SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(SDS-PAGE Sample Loading Buffer，5X)，是一種經(jīng)過改良的以溴酚藍(lán)為染料，5倍濃縮的蛋白上樣緩沖液。可以用于常規(guī)的SDS-PAGE蛋白樣品的上樣。
1.在室溫或不超過37℃的水浴中溶解SDS-PAGE上樣緩沖液(5X)。水浴溶解后立即室溫存放，盡量避免長時(shí)間置于水浴中。
2.按照每4微升蛋白樣品加入1微升蛋白上樣緩沖液(5X)的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液(5X)。
3.100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。
注意：如果起始時(shí)細(xì)胞或組織的用量較大，基因組DNA含量較高，煮沸3-5分鐘后有可能仍然比較粘稠或者有粘稠狀的半透明物體。此時(shí)需要再煮沸5-10分鐘或者加入適量稀釋成1X的蛋白上樣緩沖液后再煮沸3-5分鐘。充分煮沸后一方面可以使結(jié)合在基因組DNA上的蛋白充分釋放，同時(shí)會導(dǎo)致基因組DNA的部分?jǐn)嗔褟亩拐吵砀邢В@樣就不會影響后續(xù)的上樣操作了。
4.冷卻到室溫后，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。
5.通常電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。
SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)中含少量DTT，有輕微刺激性氣味，但不含劇毒的巰基乙醇。
SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)必須完全溶解后再使用。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
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答：可能的原因有：
1、目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)，本身可以呈現(xiàn)多條帶，建議查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小；
2、樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作；
3、雜蛋白多，建議處理目的蛋白；
4、抗體特異性不強(qiáng)，建議使用特異性強(qiáng)的抗體；
5、抗體孵育時(shí)間過久，建議減少抗體孵育時(shí)間；
6、二抗與抗原有交叉反應(yīng)，建議選擇合適的封閉物；
7、二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度；
8、底物顯色與曝光時(shí)間過長，建議縮短顯色及曝光的時(shí)間。
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