SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(SDS-PAGE Sample Loading Buffer,5X),是一種經過改良的以溴酚藍為染料,5倍濃縮的蛋白上樣緩沖液。可以用于常規的SDS-PAGE蛋白樣品的上樣。
1.在室溫或不超過37℃的水浴中溶解SDS-PAGE上樣緩沖液(5X)。水浴溶解后立即室溫存放,盡量避免長時間置于水浴中。
2.按照每4微升蛋白樣品加入1微升蛋白上樣緩沖液(5X)的比例,混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液(5X)。
3.100℃或沸水浴加熱3-5分鐘,以充分變性蛋白
注意:如果起始時細胞或組織的用量較大,基因組DNA含量較高,煮沸3-5分鐘后有可能仍然比較粘稠或者有粘稠狀的半透明物體。此時需要再煮沸5-10分鐘或者加入適量稀釋成1X的蛋白上樣緩沖液后再煮沸3-5分鐘。充分煮沸后一方面可以使結合在基因組DNA上的蛋白充分釋放,同時會導致基因組DNA的部分斷裂從而使粘稠感消失,這樣就不會影響后續的上樣操作了。
4.冷卻到室溫后,直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。
5.通常電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。
SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)中含少量DTT,有輕微刺激性氣味,但不含劇毒的巰基乙醇。
SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)必須完全溶解后再使用。
本產品僅限于專業人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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答:如果能夠排除下面的幾個問題,那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。
1、二抗的HRP 活性太強,將底物消耗光;
2、ECL底物中H2O2不穩定,失活;
3、ECL底物沒覆蓋到相應位置;
4、一抗選擇不當;
5、二抗失活。
答:可能的原因有:
1、膜沒有完全均勻濕透,建議 使用100% methanol浸透膜;
2、洗膜不充分,可以增加洗液體積和洗滌次數;
3、電極不平衡或者加樣位置偏斜,可以調整電極和加樣;
4、封閉物用量不足,可以提高封閉物濃度,孵育時保證封閉液完全浸沒轉印膜;
5、封閉物使用不當,比如檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉;
6、封閉時間不夠,一般情況下室溫37度封閉1小時以上或者4度封閉過夜;
7、抗體非特異性結合,可以降低抗體濃度,減少孵育時間;
8、一抗稀釋度不適宜,可以對抗體進行滴度測試,選擇適宜的抗體稀釋度;
9、一抗孵育的溫度偏高,建議4℃結合過夜;
10、抗體濃度過高或洗滌不夠,建議降低抗體濃度,增加洗滌次數和時間;
11、化學顯色底物過多,建議按說明書加入適量的顯色底物。
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