-
IHC實驗中無染色
答:可能的原因有:
1、IHC實驗一抗和二抗不兼容;
2、沒有足夠的一抗與目的蛋白結合;
3、抗體可能不適用于IHC,因為其可能無法識別蛋白的天然(3D)形式;
4、一抗/二抗/信號放大試劑盒可能因儲存不當、稀釋不當或多次反復凍融而失去活性;
5、該蛋白不存在于目標組織中;
6、目的蛋白在組織中含量并不豐富;
7、二抗未避光保存(進行熒光檢測時);
8、脫蠟可能不充分;
9、固定步驟可能會改變抗體識別的抗原表位;
10、抗體不能穿透蛋白所定位的細胞核(核蛋白);
11、PBS緩沖液被細菌污染,細菌會破壞目的蛋白上的磷酸基團(磷酸化蛋白);
12、抗原修復不全,對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位,以利于與抗體結合。
-
IHC實驗中非特異染色
1、一抗/二抗濃度可能過高;
2、內源性過氧化物酶具有活性;
3、使用與染色組織相同種屬來源的一抗(例如在小鼠組織上使用小鼠一抗)。應用二抗時,由于二抗是靶向組織種屬的,與組織中的免疫球蛋白或蛋白的Fc片段結合;
4、切片/細胞已干燥;
5、一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色;
6、非特異性組分與抗體結合。