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報告基因系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于真核生物基因表達和細胞生理學研究，包括受體活性、轉(zhuǎn)錄因子、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA加工和蛋白質(zhì)折疊等。“雙報告基因”通常被用來提高實驗精確度，即在一個系統(tǒng)中同時表達和測量兩個獨立的報告基因。一般來說，實驗組報告基因與具體實驗條件的影響是相關(guān)的，而共同轉(zhuǎn)染的內(nèi)對照組報告基因則是用來充當校正參數(shù)，作為內(nèi)參提供反應(yīng)基線。將實驗組的結(jié)果與內(nèi)對照組的結(jié)果進行約化處理，可降低由細胞存活率或轉(zhuǎn)染效率的差異而導(dǎo)致的結(jié)果波動，同時還可消除由取樣體積、細胞裂解效率和儀器測定引起的實驗誤差。因此雙報告基因檢測可以通過減少外部影響來獲得更可靠的實驗數(shù)據(jù)。

雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Firefly&Renilla Luciferase Reporter Assay Kit)提供了一種雙報告基因檢測方法，在同一個樣品中先以螢光素(Luciferin)為底物來檢測螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase)，后以腔腸素 (Coelenterazine)為底物來檢測海腎螢光素酶(Renillaluciferase)，同時淬滅Firefly luciferase的螢光信號，實現(xiàn)雙螢光素酶報告基因檢測。該試劑盒可靈敏高效的檢測受基因元件調(diào)控的螢光素酶表達，通常將轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5'啟動子區(qū)克隆在螢火蟲螢光素酶的上游，或把 3'-UTR 區(qū)克隆在下游，構(gòu)建成報告基因(reporter gene)質(zhì)粒。將報告基因質(zhì)粒(Firefly)和內(nèi)參質(zhì)粒(Renilla)共轉(zhuǎn)染細胞，經(jīng)給藥刺激等操作完畢后，裂解細胞并測定螢光素酶活性。通過螢光素酶活性的高低來判斷藥物處理對目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。海腎螢光素酶作為校正轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參可以消除細胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異。螢火蟲螢光素酶催化螢光素發(fā)光的強發(fā)光波長為 560nm。海腎螢光素酶催化腔腸素發(fā)光的強發(fā)光波長為465nm，具體波段選用需依據(jù)實驗需求和所用儀器進行設(shè)定，通常采用全波段接收發(fā)射信號即可，不必單獨設(shè)置。

(一)自備材料

PBS 溶液；移液器或排槍；黑色酶標板；化學發(fā)光儀或酶標儀，可配自動進樣器進行高通量檢測。

(二)檢測前準備

1. 首次使用時，將Firefly Luciferase Reaction Buffer一次性全部倒入Firefly LuciferaseSubstrate瓶中，渦旋震蕩，底物充分溶解并混勻后按單次實驗需求量進行適當分裝，避光保存于-70℃，避免反復(fù)凍融。

2. 每次使用前以1:4比例將Cell Lysis Buffer(5x)與ddH₂O充分混合，置于冰上備用。配制體積根據(jù)實驗需求，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3. 使用時將Renilla Luciferase Substrate(50x)于冰上避光暫存，計算實際使用量，以50:1的比例將適量的Stop& Renilla Reaction Buffer與Renilla Luciferase Substrate(50x)混勻，室溫避光備用。建議現(xiàn)配現(xiàn)用，剩余的反應(yīng)液當次實驗結(jié)束后，直接舍棄，不要留存。

(三)操作方法

1. 單管檢測方法

①裂解細胞

a.貼壁細胞：吸去細胞培養(yǎng)基，用PBS緩慢輕柔地洗滌一次，洗去殘留的培養(yǎng)基，然后將液體全部吸棄。懸浮細胞：離心去上清后，清洗細胞一次再次離心收集細胞沉淀。

b.按照下表推薦加入適量1×Cell Lysis Buffer，室溫下靜置或振動搖晃裂解15min，吹打并吸取全部細胞裂解產(chǎn)物至1.5ml離心管中，16000g 離心 5min，取上清用于后續(xù)檢測。

注：若螢光素酶的表達水平過低，可適當減少細胞裂解液用量以提高蛋白濃度，但需保證裂解液體積可以覆蓋細胞孔板底面否則會影響裂解效果。

②Firefly Luciferase 反應(yīng)檢測

小心吸取20μL細胞裂解上清依次加入至檢測管或酶標板中，再加入100μl平衡至室溫的含有底物的Firefly Luciferase Reaction Buffer，迅速混勻后立即于化學發(fā)光儀或酶標儀中檢測Firefly Luciferase報告基因活性。(注：務(wù)必將反應(yīng)緩沖液恢復(fù)至室溫，使酶促反應(yīng)在適溫度25℃進行。加樣后需要進行混勻，使酶促反應(yīng)充分穩(wěn)定進行。本品Firefly螢光穩(wěn)定性可達30s以上)

③Renilla Luciferase 反應(yīng)檢測

在以上反應(yīng)液中加入100μl現(xiàn)配的Renilla檢測工作液迅速混勻后立即于化學發(fā)光儀或酶標儀中檢測Renilla Luciferase報告基因活性。

2. 通過自動進樣器進行高通量檢測方法

①裂解細胞

a. 貼壁細胞：用排槍吸去細胞培養(yǎng)基，PBS 緩慢輕柔地洗滌一次，洗去殘留的培養(yǎng)基，然后將液體全部吸棄。懸浮細胞：參考單管檢測細胞收集方法，不適合原位裂解。

b. 以 96 孔板為例，用排槍每孔加入20μL 1×Cell Lysis Buffer，室溫下靜置或振動搖晃裂解15min。

②雙酶反應(yīng)檢測

按照儀器說明書完成自動進樣器的初始化操作，設(shè)定自動進樣器1為溶解底物后的Firefly LuciferaseReaction Buffer；自動進樣器2為加入底物的Stop & Renilla Reaction Buffer。設(shè)置檢測程序，通過自動進樣器 1 加入 100μL 平衡至室溫的含有底物的Firefly Luciferase Reaction Buffer，振板1-2s混勻，檢測Firefly Luciferase 報告基因活性。通過自動進樣器2加入100μl的Renilla檢測工作液，振板1-2s混勻，檢測 Renilla Luciferase 報告基因活性。以此程序完成96孔板的所有樣品檢測。(注：務(wù)必將反應(yīng)緩沖液恢復(fù)至室溫，使酶促反應(yīng)在適溫度25℃進行。加樣后，需要進行振板混勻，使酶促反應(yīng)充分穩(wěn)定進行。本品Firefly螢光穩(wěn)定性可達30s 以上)

1. 檢測儀器選擇：能夠檢測化學發(fā)光的儀器都適用本試劑盒的檢測，但是針對相同的樣品，不同檢測器本底信號值和測量值均可能不同，且對于同一樣本檢測，不同儀器的數(shù)值不可橫向比較。為防止孔間干擾，推薦使用黑色酶標板。本產(chǎn)品支持配有自動進樣器的酶標儀，可以更好的減小人為操作時間造成的孔間差異，具體操作請參考配套的自動進樣器說明書。

2. 如果體系中螢光素酶表達量較低，可適當減少裂解用量以提高蛋白濃度，同時應(yīng)增加檢測復(fù)孔的數(shù)量，以減少低濃度表達造成的孔間差異，確保結(jié)果的可靠性。

3. 酶促反應(yīng)對溫度較為敏感，加樣檢測前務(wù)必將細胞裂解產(chǎn)物和檢測底物均平衡至室溫后使用。4. 為保證螢光素酶檢測試劑穩(wěn)定性，可采取適當分裝后-70℃冰箱避光保存的方法，以避免反復(fù)凍融和長時間暴露于室溫。檢測前根據(jù)需要取適

量分裝后的反應(yīng)溶液室溫（25℃）水浴復(fù)融，充分渦旋混勻后使用。

5. 裂解產(chǎn)物與 Firefly 發(fā)光反應(yīng)液接觸后約 30s 內(nèi)螢光強度較為穩(wěn)定，為取得佳檢測結(jié)果，在使用單管的化學發(fā)光儀檢測時，不同樣品和底物混合后至上機檢測的時間間隔應(yīng)盡量一致；使用具有化學發(fā)光測定功能的多功能酶標儀時，應(yīng)先把細胞裂解液在孔內(nèi)加好，然后采用排槍統(tǒng)一加入檢測底物并盡快上機檢測。

6. 加入 Stop & Renilla Reaction Buffer 后對于螢火蟲螢光素酶的抑制可以達到99.999%以上，建議通過以下方法提高淬滅效果：使用單管的化學發(fā)光檢測儀時，加入抑制緩沖溶液后可緩慢吹打混勻2-3次即可（切勿吹起大量氣泡）；使用多功能酶標儀時，可通過增加混勻振幅或延長振動時間（1-2s）。

7. 使用配有自動進樣器的多功能酶標儀進行高通量檢測時，注意選擇合適的進樣速度。加入FireflyLuciferase Reaction Buffer 應(yīng)選擇低速模式，避免形成大量氣泡；加入Stop & Renilla ReactionBuffer可以選擇略高一些的中速模式，有助于液體充分混勻達到更好的淬滅效果。

8. Renilla Luciferase Substrate (50x) 配制在無水乙醇中。由于無水乙醇容易揮發(fā)，有時會在初次使用時發(fā)現(xiàn)體積明顯小于包裝規(guī)格的情況，此時用無水乙醇把體積補足至包裝規(guī)格，并混勻后即可使用。

9. 螢火蟲螢光素酶催化的生物發(fā)光的強波長為560 nm，海腎螢光素酶催化的生物發(fā)光的強波長為480 nm。

10. 該試劑僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

11. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。