本產品適用于從瓊脂糖凝膠或PCR產物、酶切產物中回收DNA,可回收100-10kb的DNA片段。采用了高效的膠溶解技術和高載量的硅基提取柱,具有回收得率和純度高、操作簡單、耗時短等優點。
本試劑盒提取的DNA可用于下游的酶切、PCR擴增、DNA測序、連接轉化、文庫構建等。
一、膠回收
準備工作:次使用時,在Wash Buffer中加入相應體積的乙醇。將水浴鍋打開,設置為55℃。
1、在紫外燈下從瓊脂糖凝膠中切下目標條帶,盡量精確切割目標條帶,去除不含DNA的多余瓊脂糖凝膠。(盡可能縮短紫外線長照射,避免DNA因紫外照射發生交聯引起突變)
2、稱量切下的膠條后置于干凈的2ml離心管中(可通過稱量加入膠條前后離心管的重量來計算膠條重量),加入3倍膠條體積的Buffer GM。(100mg膠條相當于100μl體積。如膠條過大,可分多管溶解,每管中膠條重量不超過400mg)
注:當瓊脂糖凝膠濃度>2%時,加入6倍體積的Buffer GM。
3、將離心管在55℃水浴中孵育5-10分鐘,期間渦旋樣品幾次,直至凝膠完全溶解。
4、加入1倍膠條體積的異丙醇。
5、將提取柱置于收集管上,將樣品加入到提取柱中(單次添加的樣品體積不超過800μl),12000rpm離心1min,之后棄去收集管中的液體。(如樣品體積過多,可分多次過柱)。
6、在提取柱中加入500μl Wash Buffer,靜置2min,12000rpm離心30s,棄去收集管中的液體。
7、在提取柱中加入200μl Wash Buffer,12000rpm離心1min。
8、將提取柱置于干凈的1.5ml離心管上,在提取柱中加入30-50μl無菌水或Buffer EB(盡量滴加在膜中央),靜置1min后12000rpm離心1min。(使用55℃預熱的水或Buffer EB能夠提高洗脫效率)
二、PCR產物回收
1、將PCR/酶切產物轉移至干凈離心管中,加入5倍體積的Buffer PB。(如樣品體積≤50μl,則加入250μl Buffer PB)
2、將提取柱置于收集管上,將樣品加入到提取柱中,12000rpm離心1min,棄去收集管中的液體。
3、在提取柱中加入500μl Wash Buffer,靜置2min,12000rpm離心30s,棄去收集管中的液體。
4、在提取柱中加入200μl Wash Buffer,12000rpm離心1min。
5、將提取柱置于干凈的1.5ml離心管中,在提取柱中加入30-50μl無菌水或Buffer EB(盡量滴加在膜中央),靜置1min后12000rpm離心1min。(使用55℃預熱的水或Buffer EB能夠提高洗脫效率)
1、產品可在15-25℃條件下保存15個月以上。
2、次使用時請根據試劑瓶上說明在Wash Buffer中加入乙醇。
3、Buffer GM和Buffer PB含有高濃度鹽分,在低溫下或長期保存會出現結晶,屬正常現象。如出現混濁或結晶,可在37℃孵育5-10min,即可恢復澄清,不影響使用。
4、本產品的DNA回收率與初始DNA量有關,初始量越低,回收率越低。
5、對于<100bp或>10kb的樣品,可適當增加吸附時間和洗脫時間。
6、Buffer EB可在使用前在55℃水浴預熱,以增加洗脫效率。
7、為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
8、本產品僅限于專業人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內。
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答:可能的原因有:
1、目的蛋白有多個修飾位點,本身可以呈現多條帶,建議查閱文獻或進行生物信息學分析,獲得蛋白序列的修飾位點信息,通過去修飾確定蛋白實際大小;
2、樣本處理過程中目的蛋白發生降解,建議加入蛋白酶抑制劑;樣本處理時在冰上操作;
3、雜蛋白多,建議處理目的蛋白;
4、抗體特異性不強,建議使用特異性強的抗體;
5、抗體孵育時間過久,建議減少抗體孵育時間;
6、二抗與抗原有交叉反應,建議選擇合適的封閉物;
7、二聚體或多聚體存在,建議增加蛋白質變性過程及強度;
8、底物顯色與曝光時間過長,建議縮短顯色及曝光的時間。
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