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磷脂酰絲氨酸（PS）是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常細(xì)胞中，PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜 PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向細(xì)胞膜外側(cè)，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被公認(rèn)為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。

    將Annexin V進(jìn)行綠色熒光Fluor 488標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此采用Annexin V與PI雙染的方法，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。

1)       此試劑盒僅供研究使用。

2)       微量試劑需離心數(shù)秒將試劑收集至管底后再開蓋取用。

3)       Propidium Iodide（PI）有毒，操作時(shí)要帶手套，使用時(shí)避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。

4)       本試劑盒用于檢測(cè)活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于1x106。

5)       染色后宜盡快檢測(cè)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。

6)       Annexin V檢測(cè)凋亡細(xì)胞的方法適用于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如：淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的檢測(cè)。對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，由于在胰酶等消化處理過(guò)程中會(huì)造成細(xì)胞膜的損傷，會(huì)造成較高的假陽(yáng)性，而用細(xì)胞刮子會(huì)造成細(xì)胞粘連成團(tuán)，而影響檢測(cè)，可將胰酶消化后的細(xì)胞保存在含2%BSA的PBS中，防止進(jìn)一步的損傷。盡管目前，包括國(guó)外也有一些單位采用該方法檢測(cè)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。我不推薦用該方法檢測(cè)。因?yàn)槠渲貜?fù)性較差，且需要操作時(shí)非常小心。

7)       消化貼壁細(xì)胞殘留的胰酶會(huì)消化并降解Annexin V-Fluor 488，終導(dǎo)致染色失敗。

8)       細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請(qǐng)不要固定樣品。