Rhodamine 123是一種可對(duì)活細(xì)胞線粒體染色的細(xì)胞染色試劑。它可透過細(xì)胞膜且在活細(xì)胞的線粒體內(nèi)聚集,并發(fā)出黃綠色熒光。Rh123的大激發(fā)波長為507nm,大發(fā)射波長為529nm。
Rh123用于對(duì)許多種細(xì)胞進(jìn)行染色,包括植物細(xì)胞和細(xì)菌。由于細(xì)胞內(nèi)ATP的量與Rh123的熒光強(qiáng)度之間有相關(guān)性,因此Rh123被應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ATP。Rh123還用于癌癥研究。
(1)將0.4mg Rh123溶解到1mL DMSO中制備成1mM Rh123-DMSO溶液。
(2)用載玻片準(zhǔn)備細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)目應(yīng)為5×104~5×105個(gè)/mL。
(3)孵育該載玻片,用PBS或Hank’s液洗滌細(xì)胞。
(4)用培養(yǎng)基稀釋1mM Rh123溶液以制備1~20μM Rh123緩沖液。
(5)將Rh123緩沖液加入載玻片并在37℃下孵育30分鐘至1小時(shí)。
(6)去除Rh123緩沖液并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞(洗滌細(xì)胞后為了固定,加入10%福爾馬林緩沖液并孵育15~20分鐘,接著用PBS洗滌)。
(7)用帶有熒光素濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。
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答:如果能夠排除下面的幾個(gè)問題,那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
1、二抗的HRP 活性太強(qiáng),將底物消耗光;
2、ECL底物中H2O2不穩(wěn)定,失活;
3、ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置;
4、一抗選擇不當(dāng);
5、二抗失活。
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