-
Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)中膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題，那么問(wèn)題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
1、二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；
2、ECL底物中H2O2不穩(wěn)定，失活；
3、ECL底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置；
4、一抗選擇不當(dāng)；
5、二抗失活。
-
Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)中背景高咋回事?
答：可能的原因有：
1、膜沒(méi)有完全均勻濕透,建議 使用100% methanol浸透膜；
2、洗膜不充分，可以增加洗液體積和洗滌次數(shù)；
3、電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調(diào)整電極和加樣；
4、封閉物用量不足，可以提高封閉物濃度，孵育時(shí)保證封閉液完全浸沒(méi)轉(zhuǎn)印膜；
5、封閉物使用不當(dāng)，比如檢測(cè)生物素標(biāo)記的蛋白時(shí)不可用脫脂奶粉封閉；
6、封閉時(shí)間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時(shí)以上或者4度封閉過(guò)夜；
7、抗體非特異性結(jié)合，可以降低抗體濃度，減少孵育時(shí)間；
8、一抗稀釋度不適宜，可以對(duì)抗體進(jìn)行滴度測(cè)試，選擇適宜的抗體稀釋度；
9、一抗孵育的溫度偏高，建議4℃結(jié)合過(guò)夜；
10、抗體濃度過(guò)高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時(shí)間；
11、化學(xué)顯色底物過(guò)多，建議按說(shuō)明書(shū)加入適量的顯色底物。
-
Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)中為啥條帶形狀不好看？
答：可能的原因有：
1、膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻；
2、某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或?qū)悠符}濃度調(diào)成一致；
3、緩沖液陳舊，成分改變,可以重配；
4、凝膠下面有氣泡,電泳前要先將氣泡趕走；
5、電泳時(shí)溫度過(guò)高，可以降低電流或電壓；
6、樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分?jǐn)嚢杌靹颉?/p>
-
Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)中蛋白條帶位置（大小）不對(duì)咋整？
答：可能的原因有：
1、膠濃度不對(duì)，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調(diào)整濃度；
2、抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間；
3、酶失活，建議直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說(shuō)明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物；
4、目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢(xún)相關(guān)文獻(xiàn)確定；
5、標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照比對(duì)結(jié)果，增加標(biāo)本上樣量。
-
Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)中有很多雜帶咋回事？
答：可能的原因有：
1、目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)，本身可以呈現(xiàn)多條帶，建議查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過(guò)去修飾確定蛋白實(shí)際大小；
2、樣本處理過(guò)程中目的蛋白發(fā)生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作；
3、雜蛋白多，建議處理目的蛋白；
4、抗體特異性不強(qiáng)，建議使用特異性強(qiáng)的抗體；
5、抗體孵育時(shí)間過(guò)久，建議減少抗體孵育時(shí)間；
6、二抗與抗原有交叉反應(yīng)，建議選擇合適的封閉物；
7、二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質(zhì)變性過(guò)程及強(qiáng)度；
8、底物顯色與曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，建議縮短顯色及曝光的時(shí)間。
-
Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)中背景有黑色斑點(diǎn)或不均勻的
答：可能的原因有：
1、抗體與封閉試劑反應(yīng)，建議使用前過(guò)濾封閉試劑；
2、HRP含量過(guò)高，建議降低酶聯(lián)二抗的濃度；
3、HRP偶聯(lián)二抗中有聚集體，建議過(guò)濾二抗試劑，去除聚集體；
4、抗體分布不均勻，建議孵育抗體時(shí)使用搖床。
-
Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞水平要做WB，多少細(xì)胞提的蛋白夠做WB？
答：一般5×10^6就足夠。
-
Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)中為什么我的細(xì)胞提取液中沒(méi)有檢測(cè)到目的蛋白？
答：可能的原因有：
1、細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；
2、抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說(shuō)明，是否有問(wèn)題；
3、可能是沒(méi)有保持低溫操作，樣品保存不當(dāng)，樣品放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；
4、細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性。
-
Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)中我的目的帶很弱，如何加強(qiáng)？
1、可以加大抗原上樣量，這是主要的；
2、也可以將一抗稀釋比例降低；
3、還可以延長(zhǎng)曝光時(shí)間。
-
Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)中我做的蛋白質(zhì)分子量很小(10KD)，怎么做WB?
1、可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系；
2、也可以選擇PSQ 膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。
