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Western Blot（WB）實驗中膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個問題，那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。
1、二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；
2、ECL底物中H2O2不穩定，失活；
3、ECL底物沒覆蓋到相應位置；
4、一抗選擇不當；
5、二抗失活。
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Western Blot（WB）實驗中背景高咋回事?
答：可能的原因有：
1、膜沒有完全均勻濕透,建議 使用100% methanol浸透膜；
2、洗膜不充分，可以增加洗液體積和洗滌次數；
3、電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調整電極和加樣；
4、封閉物用量不足，可以提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉印膜；
5、封閉物使用不當，比如檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉；
6、封閉時間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時以上或者4度封閉過夜；
7、抗體非特異性結合，可以降低抗體濃度，減少孵育時間；
8、一抗稀釋度不適宜，可以對抗體進行滴度測試，選擇適宜的抗體稀釋度；
9、一抗孵育的溫度偏高，建議4℃結合過夜；
10、抗體濃度過高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數和時間；
11、化學顯色底物過多，建議按說明書加入適量的顯色底物。
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Western Blot（WB）實驗中為啥條帶形狀不好看？
答：可能的原因有：
1、膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻；
2、某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或將樣品鹽濃度調成一致；
3、緩沖液陳舊，成分改變,可以重配；
4、凝膠下面有氣泡,電泳前要先將氣泡趕走；
5、電泳時溫度過高，可以降低電流或電壓；
6、樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分攪拌混勻。
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Western Blot（WB）實驗中蛋白條帶位置（大小）不對咋整？
答：可能的原因有：
1、膠濃度不對，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調整濃度；
2、抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長孵育時間；
3、酶失活，建議直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物；
4、目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關文獻確定；
5、標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設置陽性對照比對結果，增加標本上樣量。
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Western Blot（WB）實驗中有很多雜帶咋回事？
答：可能的原因有：
1、目的蛋白有多個修飾位點，本身可以呈現多條帶，建議查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大?。?/p>
2、樣本處理過程中目的蛋白發生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作；
3、雜蛋白多，建議處理目的蛋白；
4、抗體特異性不強，建議使用特異性強的抗體；
5、抗體孵育時間過久，建議減少抗體孵育時間；
6、二抗與抗原有交叉反應，建議選擇合適的封閉物；
7、二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質變性過程及強度；
8、底物顯色與曝光時間過長，建議縮短顯色及曝光的時間。
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Western Blot（WB）實驗中背景有黑色斑點或不均勻的
答：可能的原因有：
1、抗體與封閉試劑反應，建議使用前過濾封閉試劑；
2、HRP含量過高，建議降低酶聯二抗的濃度；
3、HRP偶聯二抗中有聚集體，建議過濾二抗試劑，去除聚集體；
4、抗體分布不均勻，建議孵育抗體時使用搖床。
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Western Blot（WB）實驗中細胞水平要做WB，多少細胞提的蛋白夠做WB？
答：一般5×10^6就足夠。
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Western Blot（WB）實驗中為什么我的細胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？
答：可能的原因有：
1、細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；
2、抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，是否有問題；
3、可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當，樣品放置時間過長；
4、細胞中的蛋白質被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性。
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Western Blot（WB）實驗中我的目的帶很弱，如何加強？
1、可以加大抗原上樣量，這是主要的；
2、也可以將一抗稀釋比例降低；
3、還可以延長曝光時間。
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Western Blot（WB）實驗中我做的蛋白質分子量很小(10KD)，怎么做WB?
1、可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉膜時間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系；
2、也可以選擇PSQ 膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可。
