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Super Fluor系列（可替代Alexa Fluor 系列）熒光探針，具有更強的熒光強度，更廣的pH應用范圍（pH 4～10）, 更好的抗淬滅性。在生物熒光領域已逐漸替代FITC,Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7等熒光染料。 Super Fluor 750 NHS= Super Fluor 750 SE～Alexa Fluor 750 SE。

A．活性染料 1mg；B．碳酸氫鈉 ～84mg；C．抗體純化樹脂P-30／Sephadex G25M／透析袋；D．空柱 5 個；E．收集管 5 個；

注意：純化的蛋白buffer中不得含有銨離子或伯銨，因為它們會與蛋白質競爭結合活性染料。不純的抗體或者含BSA或明膠的抗體標記效果不好。低濃度的NaN₃(<3mM)或thimerosal（<1mM）不影響偶聯效果。

1. 蛋白溶解：用0.1 M NaHCO₃溶解至終濃度為2mg/ml。將1ml 去離子水加入84mg NaHCO₃瓶中，配成1M碳酸氫鈉溶液。振蕩或吹打至完全溶解。該溶液pH～8.3，2～6℃保存可用2星期；若抗體是溶液，將抗體稀釋至2mg/ml，再加入1/10 體積的上述碳酸氫鈉溶液；若抗體是凍干粉，將1M 碳酸氫鈉溶液用10 倍去離子水稀釋成0.1M 后，用其將抗體溶成2mg/mL的溶液；

2. 染料溶解：染料固體粉末從冰箱放入干燥器中慢慢升至常溫后，用無水DMSO將染料配置濃度為1mg/mL.

3. 標記：在1mL蛋白溶液中緩慢加入適量染料溶液(蛋白：染料摩爾比=1:20～50；質量比可在以下范圍內優化 10～200ug Superdye每毫克IgG抗體)。同時在暗處常溫緩慢攪拌1小時(也可以直接將蛋白溶液直接加入染料的固體粉末的試劑瓶中，同時在暗處常溫緩慢攪拌1小時)。

4. 純化：選擇下面三種方式純化后，產品冷凍干燥成粉末或在0.01 M PBS/2mM疊氮化鈉溶液中，-20℃避光儲存。

5. 貯存：標記好的蛋白貯存于2～6℃，避光。若純化的蛋白偶聯物濃度小于1mg/ml，加入BSA 或其他穩定蛋白1～10mg/ml。在2mM NaN₃存在的情況下，2～6 度可保存幾個月。保存更長時間，則需分裝后-20℃保存。避免反復凍融，避光保存。

1、透析法：

1) 簡單純化可用100 mL 0.15 M NaCL溶液常溫避光透析4次,每次4小時除去未標記上的染料。

2) 在4℃用新鮮的1L0.15 M NaCl溶液再避光透析過夜。

3) 用100 mL of 0.01 M PBS/ 0.01% NaN3溶液常溫避光透析4小時，在4℃常溫避光再次透析過夜。

4) 用0.22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

2、P-30柱子

1) 0.5g p-30凝膠加入9mL PBS(pH=7.4)室溫過夜放置；次日，棄上清；真空抽濾5min;

2) 加入9mL PBS,輕柔震蕩均勻，放置20min后，去除上清液

3) 再重復2

4) 將樹脂柱放入一個13×100mm玻璃管柱中，每個柱子加入1.5mL(不要多加)，填的要均勻不能有氣泡。具體方法是：攪動純化樹脂(組分C)，加入1.0mL懸浮液至空柱中靜置；全部下沉后再加入0.5m樹脂至床體積為～1.5ml蓋上蓋子，室溫保存。

5) 將樹脂柱上下端的口打開。放入10mL離心管中，水因重力自然流下，用垂直轉子1100g 離心3min, rpm與相對離心力g的換算公式如下：相對離心力g=(1.12×10-5)(rpm)2(半徑cm)；離心后靜置待緩沖液全部流出，棄去緩沖液，保留收集管（若沒有垂直轉子，角轉子也可)

6) 換上干凈的離心管，將標記的蛋白反應液200μl逐滴加入樹脂的中心部位，使溶液被吸入膠床中；

7) 將樹脂柱放入空的收集管中，1100g 離心5min

8) 離心后收集管內是標記好的蛋白，溶在100μL PBS中(PH7.2，含2mM的NaN3)，未結合的染料保留在柱中，棄去樹脂柱。注意事項：配置柱子時，用較細的小瓶，每個小瓶配置2個柱子。便于去除水分。填柱子時，加到1.5mL、盡量不要多加，離心時間按照說明書1000g/3min

3、PD-10 column

3.1.裝填柱層析分離吸附柱

1)提前用去離子水浸泡葡聚糖Sephadex過夜(1g配5mL水)，使其溶脹，打開孔狀結構。

2) 濕法裝柱：(裝填過程中確保PBS(10mM,pH=7.4)液面比Sephadex高，以防混入空氣而產生氣泡)先在柱子(13×100mm)內注入3/4左右的PBS，而后加入Sephadex /PBS溶液；分批次、緩慢加入柱子內，后用塑料滴管吸取，沿著柱子四壁旋轉，逐步、緩慢地加入，裝填至近滿，留下約3cm的空間以待注入熒光標記蛋白溶液；

3)在裝填的個過程中打開活塞(淋出液用大燒杯承接)，同時用玻璃棒+橡膠塞從下到上輕輕敲打柱子，使Sephadex裝填緊密，注意使柱子內不得有氣泡，不得有斷層，使柱子豎直，確保頂部端面水平；(滴加Sephadex時應旋轉加入，不得直接滴加，以免激起柱頂層)

4)裝填完柱子后，用塑料滴管吸取PBS，沿管口四壁旋轉著緩慢加入，使PBS過一遍柱子，而后將PBS注入Sephadex頂部，以隔絕空氣，以免在柱內產生氣泡，關閉末端活塞；

3.2過柱層析分離吸附柱(避光)

1) 打開柱子未端活塞，緩慢放出柱子頂層的PBS，待PBS液面剛與Sephadex柱子端面相平時，立即關閉活塞；注意不要使PBS液面低于Sephadex柱子端面，以免混入空氣而在柱子內產生氣泡；立即用塑料滴管吸取熒光蛋白溶液，沿柱子四壁旋轉，緩慢加入(全部加完，不要攪動Sephadex隨時保持其端面水平)

2)待熒光蛋白溶液全部加完后，打開活塞，使熒光蛋白溶液流入柱子中；

當熒光蛋白溶液的液面剛剛完全進入柱子時，立即用塑料滴管加入PBS(緩慢沿管子四壁旋轉加入)，在熒光蛋白溶液過柱子的過程中注意隨時添加PBS，確保Sephadex端面不與空氣接觸；

3)用燒杯承接初的淋出液，幾分鐘后帶顏色的溶液便從柱子頂部往下流，而后分作三段；柱子下端(靠近活塞)：熒光標記的蛋白，帶顏色，流速較快；

柱子中間：空白無顏色部分，兩者的過渡區域；

柱子上端：未與蛋白反應的染料，帶顏色，流速較慢；

4)待下端帶顏色的熒光蛋白溶液的前沿進入活塞時，立即用5mL凍存管(錫箔紙避光)承接此淋出液(此即熒光蛋白溶液)；直至熒光蛋白溶液的尾部進入活塞口為止。

5）用10倍柱體積的PBS洗掉未反應的染料。使柱子再生后重復使用。長時間儲存柱子可用含0.05%NaN3的PBS溶液平衡柱子后，密閉封嚴在2～8℃儲存。

Super Flour 750標記蛋白F/P值計算：

1)用PBS精確倍數稀釋定量的少許純化過的偶聯蛋白，在1cm比色皿中測定280nm和750nm的光吸收；

2) 計算樣品中的蛋白濃度：蛋白摩爾濃度=(A280-(A750×0.04))×稀釋倍數/203000

3 計算標記比例：每摩爾蛋白結合的染料摩爾數=A750x稀釋信數/(240000×蛋白摩爾濃度)

1.標記效率低 計算結果顯示每摩爾145，000 MW的蛋白標記的熒光團少于4摩爾，可能有以下原因：

1)抗體緩沖液中含有痕量伯胺成分，與染料反應降低了標記效率。如果蛋白已經溶于含氨基的緩沖液(如Tris或氨基乙酸)標記前用PBS透析。

2)蛋白含量較低( ≤1mg/mL)會影響標記效率。

3) 標記步驟中加入碳酸氫鈉的作用是將反應混合物的pH升高至～8，因為在弱堿性環境中標記反應的效率高。如果蛋白溶液的緩沖范圍在低pH，建議用0.1M的NaHCO₃透析。

4) 研究顯示pH升至9.0～9.4，標記效率和標記速度(只需10min)明顯改善。

5)不同抗體與熒光團的反應速率不同，染料標記后保留的生物活性程度也不同，客戶需根據自己的條件優化標記步驟。為增加標記率，可以對同一樣品進行再標記，或減少蛋白的量加大染料的量重新標記。有研究者在室溫孵育1小時后再4℃孵育過夜，情況有所改善。

2. 過標記--計算結果顯示每摩爾145，000 MW 的蛋白標記的熒光團大于10摩爾。雖然過標記的蛋白也可以使用,但可能會引起蛋白的聚集、降低抗體結合抗原的特異性，這些都會造成非特異性結合。過標記還會引起熒光淬滅。可以增加蛋白或減少反應時間。

3.未結合染料未去除 —如果游離染料殘留在偶聯物溶液中，使標記計算的值偏高。可用分離柱再次分離或透析去除。

4.蛋白或蛋白偶聯物無法洗脫 不要再加緩沖液，只需再次離心一次或幾次。

1) 其水溶液現配現用不能儲存；

2) 任何溶解后的染料好立即使用；

3) 無水的DMSO溶液-20°C保存多2個星期。