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谷氨酸脫氫酶(GDH)位于動植物以及微生物體中，對于三羧酸循環(huán)的能量代謝、細胞內(nèi)氧化還原平衡、氨含量的穩(wěn)態(tài)維持和信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控起著至關重要的作用。它和谷氨酸合成酶（GOGAT）共同參與谷氨酸的合成，在氨同化和轉(zhuǎn)化成有機氮化合物的代謝中起重要作用。本試劑盒提供了一種簡單的比色法來檢測生物樣本中谷氨酸脫氫酶（GDH）活性。其原理是GDH催化NH₄⁺、α-酮戊二酸和NADH，生成谷氨酸和NAD⁺，NADH在340nm處有特征吸收峰，NADH的消耗引起340nm吸光度下降。通過測定340nm吸光度的下降速率，計算GDH活性

自備耗材

酶標儀或紫外分光光度計（能測 340nm處的吸光值）及恒溫培養(yǎng)箱

96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭

離心機、制冰機

去離子水

勻漿器（如果是組織樣本）

試劑準備

提取液：即用型； 4℃保存。

試劑一：即用型；使用前平衡到室溫；4℃保存。

試劑二：臨用前每瓶試劑二中加入10mL試劑一充分溶解混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后12h內(nèi)用完）。

樣本制備

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL預冷的提取液，冰浴勻漿。8,000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

細菌或細胞：先收集500萬細菌或細胞到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細菌或細胞，離心后棄上清，加入1mL預冷的提取液，冰浴超聲波破碎細菌或細胞5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次），然后, 8,000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

血清（漿）等液體樣本: 可直接測定。

注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。如需測定蛋白濃度，推薦使用BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒，進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。

實驗步驟

1. 酶標儀或可見光分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，可見光分光光度計去離子水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min。

3. 樣本測定：在96孔UV微孔板或微量石英比色皿中加入10μL樣本和190μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A₁和5min20s后的吸光值A₂，計算ΔA=A₁-A₂。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA小于0.001可適當加大樣本量。如果ΔA_測大于0.5，樣本可用提取液進一步稀釋，計算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。

結(jié)果計算

A. 用 96 孔板測定的計算公式如下：

1.按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位U。 

GDH（U/g 鮮重）＝[ΔA×V_反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V_樣÷V_樣總)÷T=1286×ΔA÷W

2. 按液體體積計算：

單位的定義：每mL液體樣本在反應體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位U。

GDH（U/mL）＝[ΔA×V_反總÷（ε×d）×10⁹]÷V_樣÷T=1286×ΔA

3. 按細菌或細胞數(shù)量計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位U。

GDH（U/10⁴ Cells)=[ΔA×V_反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V_樣÷V_樣總)÷T=2.572×ΔA

4. 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位U。

GDH（U/mg prot）＝[ΔA×V_反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V_樣×Cpr)÷T=1286×ΔA÷Cpr

V_反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；10⁹：1 mol=10⁹ nmol；V_樣：加入樣本體積，0.01mL；V_樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5min；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬個；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

B. 使用微量石英比色皿測定的計算公式

將上述計算公式中光徑 d：0.5cm 調(diào)整為 d：1cm 進行計算即可。