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GOGAT 主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非綠色組織的前質(zhì)體中，和谷氨酰胺合成酶（GS）共同構(gòu)成 GS/GOGAT 循環(huán)，參與氨同化的調(diào)控。本試劑盒提供了一種簡單的比色法來檢測生物樣本中谷氨酸合成酶（GOGAT）活性。其原理是GOGAT以 NADH 為電子供體，催化谷氨酰胺的氨基轉(zhuǎn)移到 α-酮戊二酸形成兩分子的谷氨酸，NADH 在 340nm 吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小

自備耗材

酶標(biāo)儀或紫外分光光度計(jì)（能測 340nm處的吸光值）及恒溫培養(yǎng)箱

96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭

離心機(jī)、制冰機(jī)

去離子水

勻漿器（如果是組織樣本）

試劑準(zhǔn)備

提取液：即用型； 4℃保存。

試劑一：即用型；使用前平衡到室溫；4℃保存。

試劑二：臨用前每瓶試劑二中加入9mL試劑一充分溶解混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后3h內(nèi)用完）。

樣本制備

植物組織：稱取約0.1g組織，加入1mL預(yù)冷的提取液，冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

細(xì)菌或真菌：先收集500萬細(xì)菌或真菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞，離心后棄上清，加入1mL預(yù)冷的提取液，冰浴超聲波破碎細(xì)胞5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），然后；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 酶標(biāo)儀或可見光分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，可見光分光光度計(jì)去離子水調(diào)零。

2. 試劑二置于25℃水浴5min。

3.樣本測定：在96孔UV微孔板或微量石英比色皿中加入20μL樣本和180μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A(chǔ)₁和5min20s后的吸光值A(chǔ)₂，計(jì)算ΔA=A₁-A₂。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA小于0.001可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA_測大于0.5，樣本可用提取液進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。

結(jié)果計(jì)算

A. 用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下：

1.按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。 

GOGAT（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V_反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V_樣÷V_樣總)÷T=643×ΔA÷W

2.按細(xì)菌或真菌數(shù)量計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或真菌在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GOGAT（nmol/min/10⁴ Cells)=[ΔA×V_反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V_樣÷V_樣總)÷T=1.286×ΔA

V_反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；10⁹：1 mol=10⁹ nmol；V_樣：加入樣本體積，0.02mL；V_樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬個(gè)。

B. 使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式

將上述計(jì)算公式中光徑 d：0.5cm 調(diào)整為 d：1cm 進(jìn)行計(jì)算即可。

1. 實(shí)驗(yàn)過程中請穿戴實(shí)驗(yàn)服、口罩和乳膠手套。請按照生物實(shí)驗(yàn)室的國家安全規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，尤其是在檢測血樣或其他體液時(shí)。

2. 本試劑盒僅用于實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究，如果本試劑盒用于臨床診斷或任何其他用途，我們將不對任何后果負(fù)責(zé)。

3. 本試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，并請嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行存儲。

4. 不同批次號、不同廠家之間的組分不要混用；否則，可能導(dǎo)致結(jié)果異常。

5. 勤換吸頭，避免各組分之間的交叉污染。