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硝酸還原酶（NR，EC 1.7.1.3）是一種氧化還原酶，可催化硝酸離子還原成亞硝酸離子的反應(yīng)。廣泛存在于高等植物、藻類、真菌及細(xì)菌中，是植物硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶，也是誘導(dǎo)酶，對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有影響。硝酸還原酶位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞膜外，在硝酸鹽還原途徑中是限速因子，使硝酸鹽轉(zhuǎn)換成亞硝酸鹽。本試劑盒提供了一種簡單的比色法來檢測生物樣本中硝酸還原酶活性。其原理是NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，產(chǎn)生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下，與磺胺及N-（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽定量生成紅色偶氮化合物；生成的紅色偶氮化合物在540nm有大吸收峰，測定其吸光值，可以反映NR活性。

自備耗材

酶標(biāo)儀或可見光分光光度計(jì)（能測 540nm處的吸光值）及恒溫培養(yǎng)箱

96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭

去離子水

勻漿器（如果是組織樣本）

試劑準(zhǔn)備

誘導(dǎo)劑應(yīng)用液的配制：使用時(shí)將誘導(dǎo)劑儲備液稀釋10倍，即按取1mL誘導(dǎo)劑儲備液加9mL蒸餾水的比例，充分混勻。

提取液：即用型； 4℃保存。

試劑一：即用型；使用前平衡到室溫；-20℃保存。

試劑二：臨用前每瓶加 2mL提取液溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用，溶解后的試劑，分裝，-20℃保存。

試劑三：即用型；使用前平衡到室溫；實(shí)驗(yàn)過程中避光放置；避光 4℃保存。

試劑四：即用型；使用前平衡到室溫；實(shí)驗(yàn)過程中避光放置；避光 4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：取10μL NaNO₂ 標(biāo)準(zhǔn)品（1M）用 990μL 提取液稀釋至10mM NaNO₂。取10μL 10mM 的NaNO₂ 用 990μL 提取液稀釋至100μM NaNO₂。用100μM NaNO₂按下表所示，進(jìn)行下一步稀釋：

注意：標(biāo)準(zhǔn)品現(xiàn)配現(xiàn)用；稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，必須在4小時(shí)內(nèi)使用。

樣本制備

植物組織樣品的前處理:

（1）取適量誘導(dǎo)劑于燒杯中，將新鮮標(biāo)本洗凈，濾紙吸干，放入誘導(dǎo)劑應(yīng)用液中（淹沒即可），浸泡2h，取出樣本，濾紙吸干。

（2）稱取約0.1g組織，加入1mL預(yù)冷的提取液，冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

注意：使用新鮮沒有冷凍過的樣本。一般不要誘導(dǎo)處理，預(yù)測定結(jié)果沒有活性（A_測定≤A_對照）則需要誘導(dǎo)處理。

細(xì)菌或真菌的前處理：

先收集500萬細(xì)菌或真菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞，離心后棄上清，加入1mL預(yù)冷的提取液，冰浴超聲波破碎細(xì)胞5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），然后；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

注意：樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測定酶活力，勻漿液避免反復(fù)凍融。

如需測定蛋白濃度，推薦使用BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒，進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 酶標(biāo)儀或可見光分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到540nm，可見光分光光度計(jì)去離子水調(diào)零。

2. 樣本測定（在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加樣）：

1. 充分混勻，室溫孵育20min，測定540nm處的吸光值A。計(jì)算ΔA_測=A_測定-A_對照、ΔA_標(biāo)=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_空白。空白管只需做1管。每個(gè)測定孔設(shè)一個(gè)對照孔。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本測定沒有活性（A_測定≤A_對照）則需要誘導(dǎo)處理，誘導(dǎo)處理后的樣本對照孔中試劑二改成加25μL去離子水。如果樣本吸光值大于1.2，樣本可用提取液進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。

結(jié)果計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為y軸，ΔA_標(biāo)為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度為y軸更方便計(jì)算結(jié)果）。將樣本的ΔA_測代入方程得到y值（1μM=1μmol/L=1nmol/mL）。

2. NR活性計(jì)算：

（1）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每g鮮重樣品在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO2ˉ的量為一個(gè)NR活力單位。

NR（U/g 鮮重）=y×V_反總÷(V_樣÷V_樣總×W)÷T=0.2y÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NO2ˉ的量為一個(gè) NR活力單位。

NR（U/mg prot）=y×V_反總÷(V_樣×Cpr)÷T=0.2y÷Cpr

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NO2ˉ的量為一個(gè) NR活力單位。

NR（U/10⁴ Cells）=y×V_反總÷(V_樣÷V_樣總×500)÷T=0.0004y

V_反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=0.2mL；V_樣：加入樣本體積：0.1mL；V_樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)胞數(shù)量，5×10⁶。

結(jié)果展示

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線-以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1. 實(shí)驗(yàn)過程中請穿戴實(shí)驗(yàn)服、口罩和乳膠手套。請按照生物實(shí)驗(yàn)室的國家安全規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，尤其是在檢測血樣或其他體液時(shí)。

2. 本試劑盒僅用于實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究，如果本試劑盒用于臨床診斷或任何其他用途，我們將不對任何后果負(fù)責(zé)。

3. 本試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，并請嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行存儲。

4. 不同批次號、不同廠家之間的組分不要混用；否則，可能導(dǎo)致結(jié)果異常。

5. 
勤換吸頭，避免各組分之間的交叉污染。