α-GAL (EC 3.2.1.22)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,能專一地催化α半乳糖苷鍵的水解,主要參與棉子糖、水蘇糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL對于植物種子的萌發至關重要,種子萌發初期,其催化產生的D-半乳糖通過糖酵解途徑迅速轉化和消耗,為種子的萌發提供初的能量來源,后期則主要參與細胞壁儲藏多糖水解。本試劑盒提供了一種簡單易用的比色法,用于分析各種生物樣品中α-GAL的活性。其原理是α-GAL分解對-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚,后者在400nm有大吸收峰,通過測定吸光值升高速率來計算α-GAL活性。
酶標儀或可見光分光光度計(能測400nm處的吸光度)及水浴鍋
96孔板或微量玻璃比色皿、可調節式移液槍及槍頭
離心機、制冰機
去離子水
勻漿器(如果是組織樣本)
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答:可能的原因有:
1、目的蛋白有多個修飾位點,本身可以呈現多條帶,建議查閱文獻或進行生物信息學分析,獲得蛋白序列的修飾位點信息,通過去修飾確定蛋白實際大小;
2、樣本處理過程中目的蛋白發生降解,建議加入蛋白酶抑制劑;樣本處理時在冰上操作;
3、雜蛋白多,建議處理目的蛋白;
4、抗體特異性不強,建議使用特異性強的抗體;
5、抗體孵育時間過久,建議減少抗體孵育時間;
6、二抗與抗原有交叉反應,建議選擇合適的封閉物;
7、二聚體或多聚體存在,建議增加蛋白質變性過程及強度;
8、底物顯色與曝光時間過長,建議縮短顯色及曝光的時間。
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