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谷胱甘肽有還原型（GSH）和氧化型（GSSG）兩種形態，氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽的氧化形式，又稱為二硫代谷胱甘肽，是兩分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG會被谷胱甘肽還原酶還原成GSH，因此機體中大多數是以還原型形式存在。測定細胞內 GSH 和 GSSG含量以及 GSH/GSSG 比值，能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態，也是谷胱甘肽氧化還原循環的主要指標之一。本試劑盒提供了一種簡單的檢測方法檢測各種生物樣本中GSSG的含量。還原型谷胱甘肽能和 5,5'-二硫代-雙-(2-硝基苯甲酸) (5, 5'-dithiobis- 2-nitrobenoicacid, DTNB)反應生成 2-硝基-5-巰基苯甲酸，在波長412nm 處具有大光吸收，通過2-乙烯吡啶抑制樣品中原有的還原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）將GSSG還原為GSH，借此測定氧化型谷胱甘肽的含量。

酶標儀或可見光分光光度計（能測412nm處的吸光度）及恒溫箱

96孔板或微量玻璃比色皿、可調節式移液槍及槍頭

制冰機、低溫離心機、去離子水、勻漿器（如果是組織樣本）

注意：各組分（小管試劑）開蓋前，請先低速離心。

提取液：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。

反應緩沖液：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。

試劑一：即用型；使用前，避光平衡到室溫；-20℃避光保存。

試劑二稀釋液：使用時，按取試劑二 6μL加水0.12mL的比例配制，整個實驗過程中，冰上避光放置。現用現配，用多少配多少；4℃避光保存。

試劑三：使用前96T加 2.5mL水，48T加1.25mL水溶解；分裝-20℃避光保存。

試劑四：使用前96T加 2.5mL水，48T加1.25mL水溶解；4℃避光保存。

標準品制備:

稀釋提取液：按1:10的比例用去離子水稀釋提取液，如：取250 μL 提取液加入2,250 μL去離子水。

20mM GSSG標準品：取1管標準品，用1mL 稀釋后的提取液溶解得20mM GSSG標準品；4℃避光保存。

20μM GSSG標準品：取1μL 20mM GSSG標準品用 999μL稀釋后的提取液稀釋，使用20μM GSSG標準品，按照下表所示，進一步稀釋標準品：

注意：每次實驗都要做一次標準品檢測，制作標曲；稀釋后的標準品溶液不穩定，必須在4小時內使用。

動物組織：稱取0.1g組織樣本，加入1mL預冷的提取液，快速冰上勻漿。勻漿后的樣本，8,000 g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。

植物組織：稱取0.1g植物組織剪碎，加入1mL預冷的提取液，快速冰上勻漿。勻漿后的樣本冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次）。超聲后的樣本，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。

血清或血漿：按常規方法收集血清，加入等體積的提取液，4℃，8,000g離心10min，取上清液，置冰上待測。將收集的抗凝血于4℃，600g離心10min，30min內吸取上層血漿到另一支試管中，加入等體積的提取液，4℃，8,000g離心10min，取上清液，置冰上待測。

血細胞：將收集的抗凝血于4℃，600g離心10min，棄去上層血漿，用PBS重懸，收集5×10⁶個血細胞，用冷PBS清洗2次（用PBS重懸血細胞，4℃ 600g離心10min），加入1mL預冷的提取液，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次）。超聲后的樣本，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。

細胞或細菌：收集5×10⁶個細胞或細菌，首先用冷PBS清洗細胞2次（用PBS重懸細胞，4℃ 600g 離心10min），加入1mL預冷的提取液重懸細胞或細菌，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次）。超聲后的樣本，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。

注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。提取過程中去掉蛋白質，所以提取液不能用于測定蛋白含量。

1．酶標儀或可見光分光光度計預熱30 min以上，調節波長至412nm，可見光分光光度計去離子水調零。

2．試劑二稀釋液、試劑三和試劑四37℃保溫10min。

3．在EP管中按照如下方式加樣：

4．充分混勻，37℃避光孵育10min,記錄10min時的吸光度A_空、A_標、A_測。計算ΔA_測=A_測-A_空，ΔA_標=A_標-A_空（空白管只需做1管）。

注意：1. 實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA_測小于0.005可適當加大樣本量。如果ΔA_測大于2.0，樣本可用去離子水進一步稀釋，計算結果乘以終稀釋倍數。

2. 如果樣本量過多，可將反應緩沖液、試劑二稀釋液與試劑三按照比例混勻配成工作液加入。

1. 標準曲線的繪制

以標準品濃度為y軸，ΔA_標為x軸，繪制標準曲線（濃度為y軸更方便計算結果）。

2. 含量計算

將ΔA_測帶入方程得到y值（1μM=1nmol/mL）。

（1）按樣本鮮重計算

GSSG（nmol/g 鮮重）=y×V_樣÷(W×V_樣÷V_樣總)×10×n=10y÷W×n

（2）按液體樣本體積計算

GSSG（nmol/mL）=2×y×V_樣÷V_樣×10×n=20y×n

（3）按細胞數目計算

GSSG（nmol/10⁴ cells）=y×V_樣÷(500×V_樣÷V_樣總)×10×n=0.02y×n

V_樣：反應中加入樣本體積，0.002mL,根據比例折算10μL×(21÷105)=2μL；W：樣本質量，g；V_樣總：加入提取液體積，1mL；10：樣本檢測時的稀釋倍數,(10+90)÷10；2：液體樣本制備時的稀釋倍數，加入等體積的提取液即稀釋2倍；n：樣本進一步稀釋的稀釋倍數；500：細胞數量，500萬。

典型標準曲線-以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。

1. 實驗過程中請穿戴實驗服、口罩和乳膠手套。請按照生物實驗室的國家安全規定進行實驗，尤其是在檢測血樣或其他體液時。

2. 本試劑盒僅用于實驗室科學研究，如果本試劑盒用于臨床診斷或任何其他用途，我們將不對任何后果負責。

3. 本試劑盒應在有效期內使用，并請嚴格按照說明書進行存儲。