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谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）是谷胱甘肽氧化還原循環中催化還原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GPX不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與活性氧（ROS）反應，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，從而保護生物膜免受ROS的損害，維持細胞的正常功能；而且具有保護肝臟、提高機體免疫力、拮抗有害金屬離子對機體的傷害和增加機體抗輻射等能力。GPX的活性中心是硒半胱氨酸，硒是GPX的必需部分，測定GPX的活力可以作為衡量機體硒水平的一項生化指標。本試劑盒提供了一種簡單的檢測方法，用于檢測生物樣本，如血清（漿）、動植物組織、細胞、細菌樣本中GPX的活性。GPX催化H₂O₂氧化GSH，產生GSSG；谷胱甘肽還原酶（GR）催化NADPH還原GSSG，再生GSH，同時NADPH氧化生成NADP⁺；NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP⁺沒有；通過測定340nm光吸收減少速率來計算 GPX 活性。

酶標儀或紫外分光光度計（能測340 nm處的吸光度）

96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可調節式移液槍及槍頭

恒溫箱、制冰機、低溫離心機

去離子水

勻漿器（如果是組織樣本）

試劑一：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。

工作液配制：臨用前，取試劑二一瓶，加入試劑一10mL，充分溶解后，取少量混合液于一瓶試劑三中，充分混勻后再轉移回試劑二中，混勻待用。（當天用完）

試劑四：使用前吸取試劑四21.5μL 加入5mL去離子水，充分混勻，臨用前配制，配制好的試劑當天使用；4℃避光保存。

動植物組織：稱取0.1g組織樣本，加入1mL預冷的試劑一，快速冰上勻漿。勻漿后的樣本，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。

細胞或細菌：收集500萬細胞或細菌到離心管內，用冷PBS清洗細胞或細菌，離心后棄上清，加入1mL 預冷的試劑一，冰浴超聲波破碎細胞或細菌5min（功率20％或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次），然后8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。

血清（漿）：直接測定（如需要可用生理鹽水稀釋不同倍數）。

注意：   

1. 推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月，樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，勻漿液避免反復凍融。

2. 細胞中GPX活性測定時，細胞數目須在3~5×10⁶之間，細胞中GPX的提取時可加試劑一后勻漿或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。

3. 如需測定蛋白濃度，推薦使用BCA法蛋白質定量試劑盒，進行樣本蛋白質濃度測定。

1. 酶標儀或紫外分光光度計預熱30min以上，調節波長到340nm，紫外分光光度計去離子水調零。

2. 工作液和稀釋后的試劑四置于25℃（普通物種）或者 37℃（哺乳動物）中預熱30min以上。

3. 樣本測定：在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入20μL樣本，160μL工作液，20μL稀釋后的試劑四，迅速混勻，于340nm處測定30s和210s吸光度，記為 A₁和A₂，計算△A=A₁-A₂

注意：

1. 實驗之前建議選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預實驗。如果△A小于0.001可適當加大樣本量。如果△A大于0.5，樣本可用試劑一進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數，或減少提取用樣本量。

2. 測定反應的溫度對測定結果有影響，請控制在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）。

3. 因通過反應速率計算酶活，使用96孔UV板時請根據操作速度控制一次測定的樣本數（通常一次測定4-8個樣本）。

A. 使用96孔UV微孔板測定的計算公式如下：

（1）按蛋白濃度計算

GPX 活力單位定義：一定溫度中，每毫克蛋白在反應體系中每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個酶活單位。

GPX(U/mg prot)=[△A÷(ε×d)×V_反總×10⁹]÷(Cpr×V_樣)÷T=1072×△A÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

GPX 活力單位定義：一定溫度中，每克樣品在反應體系中每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個酶活單位。

GPX（U/g 鮮重）=[△A÷(ε×d)×V_反總×10⁹]÷(V_樣÷V_樣總×W)÷T=1072×△A÷W

（3）按細胞數量計算

GPX 活力單位定義：一定溫度中，每 10⁴個細胞在反應體系中每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個酶活單位。

GPX(U/10⁴ Cells)=[△A÷(ε×d)×V_反總×10⁹]÷(500×V_樣÷V_樣總)÷T=1072×△A÷500=2.144×△A

（4）按液體體積計算

活性單位定義：一定溫度中，每毫升液體樣本在反應體系中每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個酶活單位。

GPX(U/mL)=[△A÷(ε×d)×V_反總×10⁹]÷V_樣÷T=1072×△A

ε：NADPH 摩爾消光系數，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V_反總：反應體系總體積，200μL=2×10^-4 L；10⁹：1 mol=1×10⁹nmol；Cpr：上清液蛋白濃度mg/mL；W：樣品質量，0.1g；V_樣：加入反應體系中上清液體積，20μL =0.02mL；V_樣總：提取液體積，1mL；T：反應時間，3min；500：細胞數量，500萬。

B. 使用微量石英比色皿進行測定的計算公式

將上述計算公式中光徑 d：0.5cm 調整為 d：1cm 進行計算即可。