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硫氧還蛋白過氧化物酶（TPX）屬于過氧化物酶家族，在體內主要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實現抗氧化作用，功能與谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）類似，也是谷胱甘肽氧化還原循環關鍵酶之一。TPX普遍存在于各種生物體內，如酵母、植物、動物、原生動物、寄生蟲、細菌和古細菌，在進化上高度保守。TPX與細胞增殖、分化、細胞凋亡及腫瘤發生調控密切相關。TPX的主要功能包括細胞脫毒、抗氧化和調節由過氧化氫介導的信號轉導和免疫反應。本試劑盒提供了一種簡單的檢測方法檢測生物樣本，如血清（漿）、動植物組織、細胞及細菌樣本中TPX的活性。TPX催化H₂O₂氧化二硫蘇糖醇（DTT），通過測定240 nm（H₂O₂的吸收波長）吸光度的下降速率，用總活性減去過氧化氫酶（CAT）催化分解的H₂O₂，即可計算出TPX活性。本試劑盒可以同時測定樣品TPX和CAT活性。 

酶標儀或紫外分光光度計（能測240 nm處的吸光度）及水浴鍋

96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可調節式移液槍及槍頭

低溫離心機、制冰機

去離子水

勻漿器（如果是組織樣本）

試劑一：即用型；室溫保存。

試劑二：即用型；使用前，平衡至室溫；-20℃避光保存。

試劑三：即用型；使用前，平衡至室溫；4℃避光保存。

動植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mL 試劑一，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。

細胞、細菌：收集500萬細胞或細菌到離心管內，用冷PBS清洗細胞，離心后棄上清，加入1mL 試劑一，冰浴超聲波破碎細胞或細菌5min（功率20%或200 W，超聲3s，間隔7s，重復30次），然后8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。

血清等液體的準備：直接測定。

注意：1. 推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月，樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，勻漿液避免反復凍融。

2， 細胞中TPX活性測定時，細胞數目須在3-5×10⁶之間，細胞中TPX的提取時可加試劑一后勻漿或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。

3. 如需測定蛋白濃度，推薦使用BCA法蛋白質定量試劑盒，進行樣本蛋白質濃度測定。

1．酶標儀或紫外分光光度計預熱30min以上，調節波長至240nm，紫外分光光度計去離子水調零。

2．試劑一和試劑二置于 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動物）預熱30min。

3．樣本測定：在96孔UV板或微量石英比色皿中加樣，每孔先加入4μL樣本上清液，再加入180μL 試劑一（CAT活性測定）或 180μL 試劑二（總活性測定），后加入16μL試劑三，充分混勻。測定240nm處的吸光值，分別記錄10s和130s吸光值，測CAT活性記為A₁和A₂，測總活性測定記為A₃和A₄。

注意：1. 實驗之前建議選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預實驗。

2. 測定反應的溫度對測定結果有影響，請控制在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）。

3. 因通過反應速率計算酶活，使用96孔UV板時請根據操作速度控制一次測定的樣本數（通常一次測定4-8個樣本）。

A. 使用96孔UV微孔板測定的計算公式如下

(1) 按蛋白濃度計算

活性單位(U)定義：25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個酶活單位。

CAT活性(U/mg prot)=(A₁-A₂)÷(ε×d)×V_反總÷(Cpr×V_樣) ÷T=1147×(A₁-A₂)÷Cpr

總活性(U/mg prot)=(A₃-A₄)÷(ε×d)×V_反總÷(Cpr×V_樣)÷T=1147×(A₃-A₄)÷Cpr

TPX 活性(U/mg prot)=總活性-CAT活性

（2）按樣本鮮重計算

活性單位(U)定義： 25℃或者 37℃中，每克樣品每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個酶活單位。

CAT活性(U/g 鮮重)=(A₁-A₂)÷(ε×d)×V_反總÷(V_樣÷V_樣總×W)÷T=1147×(A₁-A₂)÷W

總活性(U/g 鮮重)= (A₃-A₄)÷(ε×d)×V_反總÷(V_樣÷V_樣總×W)÷T=1147×(A₃-A₄)÷W

TPX 活性(U/g 鮮重)=總活性-CAT活性

（3）細胞數量計算

活性單位(U)定義：25℃或者 37℃中，每10⁴個細胞每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個酶活單位。

CAT活性(U/10⁴ cells)= (A₁-A₂)÷(ε×d)×V_反總÷(500×V_樣÷V_樣總)÷T=1147×(A₁-A₂)÷500=2.294×(A₁-A₂)

總活性(U/10⁴ cells)=(A₃-A₄)÷(ε×d)×V_反總÷(500×V_樣÷V_樣總)÷T=1147×(A₃-A₄)÷500=2.294×(A₃-A₄)

TPX 活性(U/10⁴ cell）=總活性-CAT活性

（4）按液體體積計算

活性單位(U)定義：25℃或者 37℃中，每毫升液體每分鐘催化催化1nmol H₂O₂降解為1個酶活單位。

CAT活性（U/mL）=(A₁-A₂)÷(ε×d)×V_反總÷V_樣÷T=1147×(A₁-A₂)

總活性（U/mL）=(A₃-A₄)÷(ε×d)×V_反總÷V_樣÷T=1147×(A₃-A₄)

TPX活性（U/mL）=總活性-CAT活性

ε： H₂O₂摩爾消光系數，43600 L/mol/cm=0.0436 mL/nmol/cm； d：96孔板光徑，0.5cm；V_反總：反應體系總體積，200μL=0.2mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL； W：樣品質量，0.1g；V_樣：加入反應體系中上清液體積，4μL = 4×10^-3 mL； V_樣總：提取液體積，1mL；T：反應時間，2min； 500：細胞數量， 5×10⁶。

B. 使用微量石英比色皿進行測定的計算公式

將上述計算公式中光徑 d：0.5cm 調整為 d：1cm 進行計算即可。