谷胱甘肽S-轉移酶（GST）是一種具有多種生理功能的蛋白質家族，主要存在于細胞質內。GST是體內解毒酶系統的重要組成部分，主要催化各種化學物質及其代謝產物與GSH的巰基共價結合，使親電化合物變為親水化合物，易于從膽汁或尿液中排泄，達到將體內各種潛在或具有毒性的物質降解并排出體外的目的。因此，GST在保護細胞免受親電化合物的損傷中發揮著重要的生物學功能。GST具有GSH-Px活性，亦稱為non-Se GSH-Px，具有修復氧化破壞的大分子如DNA、蛋白質等的功能。GST催化反應會減少GSH含量，但是不增加GSSG含量。本試劑盒提供了一種簡單的檢測方法，用于檢測生物樣本，如血清（漿）、動植物組織、細胞、細菌樣本中GST的活性。GST催化GSH與CDNB結合，其結合產物的光吸收峰波長為340nm；通過測定340nm波長處吸光度上升速率，即可計算出GST活性。
酶標儀或紫外分光光度計（能測340 nm處的吸光度）
96孔UV板或微量石英比色皿、可調節式移液槍及槍頭
恒溫箱、低溫離心機、制冰機
去離子水
勻漿器（如果是組織樣本）
提取液：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。
顯色物：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。
底物：使用前加入2mL離子水溶解；4℃避光保存。
動植物組織：稱取0.1g組織樣本，加入1mL預冷的提取液，快速冰上勻漿。勻漿后的樣本，8,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。
細胞或細菌：收集 5×106細胞或細菌到離心管內，用冷PBS清洗細胞，離心后棄上清，加入1mL 提取液，冰浴超聲波破碎細胞或細菌5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次），然后8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。
血清（漿）：直接測定。
注意：
1. 樣品處理等過程均需要在冰上進行，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存一個月。
2. 細胞中GST活性測定時，細胞數目須在3-5×106之間，細胞中GST的提取時可加提取液后勻漿或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。
3. 如需測定蛋白濃度，推薦使用BCA法蛋白質定量試劑盒進行樣本蛋白質濃度測定。
1. 酶標儀或紫外分光光度計預熱 30min 以上，調節波長到340nm，可見紫外分光光度計去離子水調零。
2. 顯色物和底物置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）孵育15min。
3. 樣本測定：在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入20μL樣本，180μL 顯色物和20μL底物，
迅速混勻后于340nm 測定吸光度變化，記錄10s和 310s 吸光度為A1和A2。計算△A=A2-A1，
注意：
1. 實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。若5min 內反應不成線性（可每分鐘測定1次觀察變化趨勢），建議對樣品用去離子水稀釋，計算時結果乘以稀釋倍數。
2. 測定反應的溫度對測定結果有影響，請控制在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）。
3. 因通過反應速率計算酶活，使用96孔UV板時請根據操作速度控制一次測定的樣本數（通常一次測定4-8個樣本）。
A. 使用96孔UV板測定的計算公式
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：在 25℃或37℃中，每毫克蛋白在反應體系中每分鐘催化1nmol CDNB與GSH結合。
GST（U/mg prot）=[△A÷(ε×d)×V反總×109]÷(Cpr×V樣)÷T=460×△A÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣品在反應體系中每分鐘催化1nmol CDNB與GSH結合。
GST（U/g 鮮重）=[△A÷(ε×d)×V反總×109]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=460×△A÷W
（3）按細胞數量計算
活性單位定義：在25℃或者37℃中，每104個細胞在反應體系中每分鐘催化1nmol CDNB與GSH結合。
GST（U/104 Cells）=[△A÷(ε×d)×V反總×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=460×△A÷500=0.92×△A
（4）按液體體積計算
活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體樣本在反應體系中每分鐘催化1nmol CDNB與GSH結合。
GST（U/mL）=[△A÷(ε×d)×V反總×109]÷V樣÷T=460×△A
ε：產物摩爾消光系數，9.6×103 L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；109：1mol=1×109nmol；V反總：反應體系總體積，220μL=2.2×10-4L；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5min；500：細胞數量，5×106。
B. 使用微量石英比色皿測定的計算公式
將上述計算公式中的光徑d：0.5cm調整為d：1cm進行計算即可。
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答：可能的原因有：
1、膜沒有完全均勻濕透,建議 使用100% methanol浸透膜；
2、洗膜不充分，可以增加洗液體積和洗滌次數；
3、電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調整電極和加樣；
4、封閉物用量不足，可以提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉印膜；
5、封閉物使用不當，比如檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉；
6、封閉時間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時以上或者4度封閉過夜；
7、抗體非特異性結合，可以降低抗體濃度，減少孵育時間；
8、一抗稀釋度不適宜，可以對抗體進行滴度測試，選擇適宜的抗體稀釋度；
9、一抗孵育的溫度偏高，建議4℃結合過夜；
10、抗體濃度過高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數和時間；
11、化學顯色底物過多，建議按說明書加入適量的顯色底物。
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