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谷胱甘肽還原酶（GR）是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，GR催化GSSG還原生成GSH，是谷胱甘肽氧化還原循環的關鍵酶之一（通常昆蟲中GR被硫氧還蛋白還原酶（TrxR）取代）。GR催化NADPH還原GSSG生成GSH，有助于維持體內GSH/GSSG比值平衡。GR在氧化脅迫反應中對活性氧清除起關鍵作用，此外，GR還參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環途徑。本試劑盒提供了一種簡單的檢測方法，用于檢測生物樣本，如血清（漿）、動植物組織、細胞以及細菌樣本中GR的活性水平。其原理是，GR能催化NADPH還原GSSG再生GSH，同時NADPH脫氫生成NADP⁺；NADPH在340nm有特征吸收峰，相反NADP⁺在該波長無吸收峰；通過測定340nm吸光度下降速率來測定NADPH脫氫速率，從而計算GR活性。

酶標儀或紫外分光光度計（能測340nm處的吸光度）及水浴鍋

96孔UV板或微量石英比色皿、可調節式移液槍及槍頭

低溫離心機

去離子水

勻漿器（如果是組織樣本）

試劑一: 即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。

試劑二: 即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。

試劑三：粉劑；使用前96T每管加入2mL去離子水，48T加入1mL去離子水，混勻，現配現用，置于冰上；分裝-20℃避光保存。

動植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mL預冷的試劑一，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。

細胞或細菌：收集500萬細胞或細菌到離心管內，用冷PBS清洗細胞，離心后棄上清，加入1mL預冷的試劑一，冰浴超聲波破碎細胞或細菌5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次），然后10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。

血清（漿）：直接測定。

注意：   

1. 推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月，樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，勻漿液避免反復凍融。

2. 細胞中GR活性測定時，細胞數目須在3~5×10⁶之間，細胞中GR的提取時可加試劑一后勻漿或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。

3. 如需測定蛋白濃度，推薦使用BCA法蛋白質定量試劑盒，進行樣本蛋白質濃度測定。由于試劑一中含有一定濃度的蛋白（約0.1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去試劑一本身的蛋白含量。

1. 酶標儀或紫外分光光度計預熱30min以上，調節波長到340nm，紫外分光光度計去離子水調零。

2. 試劑一置于25℃（普通物種）或者 37℃（哺乳動物）中預熱30min以上。

3. 樣本測定：在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入10μL試劑二，20μL試劑三，20μL樣本，150μL試劑一，混勻，于340nm 測定10s和190s吸光度，記為 A₁和A₂，計算△A=A₁-A₂

注意：

1. 實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。確保180s內吸光值變化呈線性（可每分鐘測定1次觀察變化趨勢），當出現初始180s內吸光值不穩定時，可以適當延長反應時間，選取相對穩定的時間段內吸光值變化值。如果ΔA小于0.001可適當加大樣本量；如果吸光值變化較為劇烈且不呈線性，樣本可用試劑一進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數，哺乳動物組織一般須用試劑一稀釋2~5倍。

2. 測定反應的溫度對測定結果有影響，請控制在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）。

3. 因通過反應速率計算酶活，使用96孔UV板時請根據操作速度控制一次測定的樣本數（通常一次測定4-8個樣本）。

A. 使用96孔板測定的計算公式

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：在一定溫度，pH 8.0條件下，每毫克蛋白在反應體系中每分鐘催化1nmol NADPH氧化。

GR酶活(U/mg prot)=[△A÷(ε×d)×V_反總×10⁹]÷(Cpr×V_樣)÷T=1072×△A÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

活性單位定義：在一定溫度，pH 8.0 條件下每克樣品在反應體系中每分鐘催化1nmol NADPH氧化。

GR酶活(U/g 鮮重)= [△A÷(ε×d)×V_反總×10⁹]÷(V_樣÷V_樣總×W)÷T=1072×△A÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義：在一定溫度，pH 8.0 條件下，每10⁴個細胞在反應體系中每分鐘催化1nmol NADPH氧化。

GR酶活(U/10⁴ Cells)=[△A÷(ε×d) ×V_反總×10⁹]÷(500×V_樣÷V_樣總)÷T=2.144×△A 

（4）按液體體積計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH 8.0 條件下，每毫升液體樣本在反應體系中每分鐘催化1nmol NADPH氧化。

GR 酶活(U/mL)=[△A÷(ε×d)×V_反總×10⁹]÷V_樣÷T=1072×△A

ε：NADPH 摩爾消光系數 6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V_反總：反應體系總體積，200μL=2×10^-4 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；V_樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=2×10^-2 mL；V_樣總：提取液體積，1mL；T：反應時間，3min；500：細胞數量，5×10⁶。

B. 使用微量玻璃比色皿測定的計算公式

將上述計算公式中的光徑d:0.5cm調整為d:1cm進行計算即可。