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NADPH 氧化酶（NAO）廣泛存在于動(dòng)物、植物和真菌中，是一個(gè)典型的膜蛋白，催化NADPH氧化生成NADP+，并將電子傳遞給氧原子從而產(chǎn)生超氧陰離子。該酶異常可導(dǎo)致人慢性肉芽腫病（GCD），在植物中，該酶與其抗病性和各種脅迫有密切關(guān)系。本試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法檢測(cè)生物樣本中NADPH 氧化酶（NAO）的活性水平。其原理是NADPH 氧化酶（NAO）將 NADPH氧化為NADP+，NADPH在340nm有特征吸收峰，而 NADP+沒有；通過測(cè)定 340nm吸光度減少的速率來計(jì)算得出NAO酶活性大小。

酶標(biāo)儀或紫外分光光度計(jì)（能測(cè)340nm處的吸光度）

96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭

恒溫箱、制冰機(jī)、低溫離心機(jī)

去離子水

勻漿器（如果是組織樣本）

提取液：即用型；4℃保存。

反應(yīng)緩沖液：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。

試劑一：臨用前配制；用前96T加入5mL去離子水，48T加入2.5mL去離子水，未用完試劑分裝-20℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)冰上放置，避免反復(fù)凍融。

動(dòng)植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mL預(yù)冷的提取液，冰浴勻漿，12,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。

細(xì)胞：收集5×10⁶個(gè)細(xì)胞，用冷PBS清洗細(xì)胞后棄上清，加入1mL預(yù)冷的提取液冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次）。12,000g，4℃，離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

血清、血漿等液體樣本：可直接測(cè)定，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定稀釋倍數(shù)。

注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個(gè)月。如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。

1．酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340nm，可見分光光度計(jì)去離子水調(diào)零。

2．反應(yīng)緩沖液置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）預(yù)熱15min。

3．樣本測(cè)定：在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10μL樣本，150μL反應(yīng)緩沖液和40μL試劑一。充分混勻，記錄340nm處1min 20s時(shí)吸光值A₁，迅速放入25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）恒溫箱中，準(zhǔn)確反應(yīng) 5min。迅速取出記錄6min 20s時(shí)的吸光度 A₂。計(jì)算ΔA=A₁-A₂。

注意：1.實(shí)驗(yàn)之前建議選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA小于0.001可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間T（如至10min或更長(zhǎng)），或適當(dāng)加大樣本量；注意對(duì)計(jì)算公式進(jìn)行調(diào)整。如果ΔA大于1.0，可用提取液稀釋樣品，計(jì)算時(shí)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。

2. 測(cè)定反應(yīng)的溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響，請(qǐng)控制在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）。

3. 因通過反應(yīng)速率計(jì)算酶活，使用96孔板時(shí)請(qǐng)根據(jù)操作速度控制一次測(cè)定的樣本數(shù)（通常一次測(cè)定4-8個(gè)樣本）。

NAO活力單位的計(jì)算

A. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式

1. 按樣本鮮重計(jì)算

活力單位定義：一定條件下，每g樣品在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

6PGDH（U/g 鮮重）=[△A×V_反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V_樣÷V_樣總×W)÷T=1286×ΔA÷W

2. 按液體體積計(jì)算

活性單位定義：一定條件下，每mL液體樣本在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。6PGDH(U/mL)=[△A×V_反總÷(ε×d)×10⁹]÷V_樣÷T=1286×ΔA

3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活力單位定義：一定條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

6PGDH(U/10⁴ Cells)=[△A×V_反總÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V_樣÷V_樣總)÷T=1286×△A÷500=2.572×△A

（4）按蛋白濃度計(jì)算

活力單位定義：一定條件下，每毫克蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

6PGDH(U/mg prot)=[△A×V_反總÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V_樣)÷T=1286×△A÷Cpr

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V_反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；V_樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，10μL =0.01mL；V_樣總：提取液體積，1mL；Cpr：上清液蛋白濃度mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；500：細(xì)胞數(shù)量，500萬。

B. 使用微量石英比色皿進(jìn)行測(cè)定的計(jì)算公式

將上述計(jì)算公式中光徑 d：0.5cm 調(diào)整為 d：1cm 進(jìn)行計(jì)算即可。