蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代謝關(guān)鍵酶之一。根據(jù)適pH，Ivr 分為酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（NI）兩種類型。AI的適pH為3～5。AI分為可溶性AI(S-AI)和細(xì)胞壁不溶性AI（B-AI）兩種類型。S-AI主要存在于細(xì)胞液泡或自由空間中，適 pH 為4.5~5.0（酸性），通過降解液泡中蔗糖，調(diào)節(jié)液泡中蔗糖的利用和果實(shí)內(nèi)糖類的積累。本試劑盒提供了一種檢測S-AI活性的便捷方法，其原理是S-AI催化蔗糖降解產(chǎn)生還原糖，進(jìn)一步與3,5－二硝基水楊酸反應(yīng)，生成棕紅色氨基化合物，在540nm有特征光吸收，在一定范圍內(nèi)540nm光吸收增加速率與S-AI活性成正比。測定540nm吸光度的變化可計(jì)算S-AI活力。
試劑盒組分 | 規(guī)格 | 儲(chǔ)存條件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
試劑一 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | 粉劑×1瓶 | 4℃保存 |
試劑三 | 7.5mL | 15mL | 常溫避光保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品（10mg葡萄糖） | 粉劑×1支 | 粉劑×1支 | 4℃保存 |
酶標(biāo)儀或可見光分光光度計(jì)（能測540nm處的吸光度）
水浴鍋、制冰機(jī)、低溫離心機(jī)
96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭
去離子水
勻漿器
注意：各組分（小管試劑）開蓋前，請先低速離心。
提取液: 即用型；4℃保存。
試劑一：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。
試劑二: 臨用前48T加入5mL試劑一，96T加入10mL試劑一充分溶解待用；用不完的試劑可4℃保存一周或分裝-20長期保存。
試劑三: 即用型；常溫避光保存，若有黃色晶體析出，需 90℃加熱溶解后再用。
標(biāo)準(zhǔn)品：含10 mg無水葡萄糖，臨用前加入1mL去離子水溶解得10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品。溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品可4℃保存1個(gè)月或分裝-20℃長期保存。
標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：按下表所示，用去離子水將10mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
標(biāo)準(zhǔn)品體積（μL） | 去離子水體積（μL） | 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL） | |
標(biāo)準(zhǔn)品1 | 40μL 10mg/mL | 160 | 2 |
標(biāo)準(zhǔn)品2 | 100μL of 標(biāo)準(zhǔn)品1 (2mg/mL) | 100 | 1 |
標(biāo)準(zhǔn)品3 | 100μL of 標(biāo)準(zhǔn)品2 (1mg/mL) | 100 | 0.5 |
標(biāo)準(zhǔn)品4 | 100μL of 標(biāo)準(zhǔn)品3 (0.5mg/mL) | 100 | 0.25 |
標(biāo)準(zhǔn)品5 | 100μL of 標(biāo)準(zhǔn)品4 (0.25mg/mL) | 100 | 0.125 |
標(biāo)準(zhǔn)品6 | 100μL of 標(biāo)準(zhǔn)品5 (0.125mg/mL) | 100 | 0.0625 |
標(biāo)準(zhǔn)品7 | 100μL of 標(biāo)準(zhǔn)品6 (0.0625mg/mL) | 100 | 0.0313 |
注意：每次實(shí)驗(yàn)，請使用新配制的標(biāo)準(zhǔn)品。
樣本制備
組織：稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液，冰浴勻漿，12,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。
注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個(gè)月。如需測定蛋白濃度，推薦使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。由于提取液中含有一定濃度的蛋白（1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量。
1. 酶標(biāo)儀或可見光分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到540nm，可見光分光光度計(jì)去離子水調(diào)零。
2. 樣本測定（在EP管中依次加入下列試劑）：
試劑（μL） | 測定管 | 對照管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 |
樣本 | 50 | 50 | 0 | 0 |
試劑一 | 0 | 200 | 0 | 0 |
試劑二 | 200 | 0 | 200 | 200 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 0 | 0 | 50 | 0 |
去離子水 | 0 | 0 | 0 | 50 |
混勻，37℃準(zhǔn)確水浴30min后，95℃水浴10min（蓋緊，以防水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變） | ||||
試劑三 | 125 | 125 | 125 | 125 |
混勻，95℃水浴10min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻，吸取200μL于96孔板或者微量比 色皿中，測定540nm 處各管的吸光值，空白孔記為A空，標(biāo)準(zhǔn)孔記為A標(biāo)，測定孔記為A測，對照孔記為A對。計(jì)算ΔA測=A測-A對，ΔA標(biāo)=A標(biāo)-A空。標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白管只要測定一次，每個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對照管。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA測小于0.001可適當(dāng)加大樣本量。如果A測大于2.0，樣本可用去離子水進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為y軸，ΔA標(biāo)為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度為y軸更方便計(jì)算結(jié)果）。
將ΔA測帶入方程得到 y（mg/mL）。
2. S-AI酶活性計(jì)算
（1）按照樣本鮮重計(jì)算
單位定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化蔗糖水解生成1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
S-AI酶活（U/g 質(zhì)量）=y×V反總×103÷(V樣÷V樣總×W)÷T=166.67y÷W
（2）按照蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化蔗糖水解生成1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
S-AI酶活（U/mg prot）=y×V反總×103÷(V樣×Cpr)÷T=166.67y÷Cpr
V反總：反應(yīng)總體積，0.25mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；103：單位換算系數(shù)，1mg=103μg；W：樣本鮮重，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；T ：反應(yīng)時(shí)間：30min。
典型標(biāo)準(zhǔn)曲線
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可能原因 解決措施是
1，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不正確。 確保標(biāo)準(zhǔn)品按照推薦方法溶解和稀釋。
2，移液不準(zhǔn)確。 定期校準(zhǔn)移液器并檢查槍頭密封性。
3，反應(yīng)液蒸發(fā)。 用封板膜密封酶標(biāo)板。
4，洗板不徹底。 足夠的洗滌次數(shù)和加入足量洗滌液。
5，孔底有異物。 讀數(shù)前清潔板底。
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