丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)廣泛存在于動(dòng)物、霉菌和酵母的線粒體中，但在植物體和大部分細(xì)菌中卻不含此酶。它是供給草酰乙酸的主要補(bǔ)充反應(yīng)，催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，是糖異生過程的個(gè)限速酶，在保證血糖的動(dòng)態(tài)平衡方面起著重要的作用。本試劑盒提供了一種簡單的檢測(cè)方法，用于檢測(cè)生物樣本中PC的活性。其原理是PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，通過測(cè)定Pi增加速率來反映PC活性。
試劑盒組分 | 規(guī)格 | 儲(chǔ)存條件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
試劑一 | 9mL | 18mL | 4℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1支 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1支 | 粉劑×1支 | 4℃保存 |
試劑四 | 粉劑×1支 | 粉劑×1支 | 4℃保存 |
試劑五 | 粉劑×1支 | 粉劑×1支 | 4℃保存 |
試劑六 | 5mL | 10mL | 室溫保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)（能測(cè)660nm處的吸光度）及水浴鍋
96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭
低溫離心機(jī)、制冰機(jī)
去離子水
勻漿器
注意：各組分（小管試劑）開蓋前，請(qǐng)先低速離心。
提取液：即用型；4℃保存。
試劑一：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。
試劑二：臨用前在試劑四瓶中48T加入0.5mL去離子水，96T加入1mL去離子水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
試劑三：臨用前配制，48T加入2mL去離子水充分溶解，96T加入4mL去離子水充分溶解后使用。
試劑四：臨用前配制，48 T加入5mL去離子水充分溶解，96T加入10mL去離子水充分溶解后使用。
試劑五：臨用前配制，48 T加入5mL去離子水充分溶解，96 T加入10mL去離子水充分溶解后使用。
試劑六：即用型；室溫保存。
定磷試劑的配制：配制比例按照H2O : 試劑四: 試劑五: 試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染（請(qǐng)根據(jù)需要，用多少配多少）。
注意：配試劑好用新的玻璃器皿或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：按下表所示用去離子水將10mM 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mM 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
標(biāo)準(zhǔn)品體積（μL） | 去離子水體積（μL） | 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mM） | |
Std.1 | 100μL 10mM | 900 | 1 |
Std.2 | 100μL of Std.1 (1mM) | 100 | 0.5 |
Std.3 | 100μL of Std.2 (0.5mM) | 100 | 0.25 |
Std.4 | 100μL of Std.3 (0.25mM) | 100 | 0.125 |
Std.5 | 100μL of Std.4 (0.125mM) | 100 | 0.0625 |
Std.6 | 100μL of Std.5 (0.0625mM) | 100 | 0.0313 |
Std.7 | 100μL of Std.6 (0.0313mM) | 100 | 0.0156 |
組織、真菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1. 稱取約0.1g組織或收集500萬真菌或細(xì)胞，加入1mL提取液，冰浴勻漿。
2. 將勻漿液600g，4℃離心5min。
3. 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4. 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的PC（此步可選做）。
5. 在步驟4的沉淀中加入1mL提取液，超聲波破碎5min（功率20％或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），用于線粒體PC活性測(cè)定。
注意：1. 推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Bradford法蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。
2. 對(duì)于脂肪含量較高的動(dòng)物組織，離心后移除上層脂肪，再取上清液。
1. 酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到660nm，可見分光光度計(jì)去離子水調(diào)零。
2. 酶促反應(yīng)（在EP管中依次加入下列試劑）：
空白管（μL） | 標(biāo)準(zhǔn)管（μL） | 測(cè)定管（μL） | 對(duì)照管（μL） | |
試劑一 | 0 | 0 | 180 | 180 |
試劑二 | 0 | 0 | 10 | 10 |
樣本 | 0 | 0 | 10 | 0 |
混勻后蓋緊，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確孵育30min | ||||
試劑三 | 0 | 0 | 20 | 20 |
樣本 | 0 | 0 | 0 | 10 |
混勻后，室溫（25℃左右），4,000g，離心10min，取上清液； | ||||
3. 定磷(在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列試劑） | ||||
上清 | 0 | 0 | 40 | 40 |
不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品 | 0 | 40 | 0 | 0 |
去離子水 | 40 | 0 | 0 | 0 |
定磷試劑 | 200 | 200 | 200 | 200 |
混勻，室溫靜置10min后，測(cè)定660nm吸光值。計(jì)算ΔA測(cè)=A測(cè)定-A對(duì)照，ΔA標(biāo)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。（空白管只需做 1 管） | ||||
4. 注意：為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測(cè)定的吸光值過高（高于1.5）可用試劑二稀釋樣本后再測(cè)定，計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為y軸，ΔA標(biāo)為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度為y軸更方便計(jì)算結(jié)果）。
2. 無機(jī)磷（Pi）含量的計(jì)算
將?A測(cè)帶入方程得到y值（mM）。
3. PC活性計(jì)算
（1）按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位U。
上清中PC活性的計(jì)算：
PC上清活性(U/g 鮮重)= (y上清×V酶促×106)÷(V樣÷V提取×W)÷T=666.67×y上清÷W
沉淀中PC活性的計(jì)算:
PC沉淀活性(U/g 鮮重)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V樣÷V重懸×W)÷T=666.67×y沉淀÷W
樣本PC總活性的計(jì)算：
樣本PC總活性即為上清中PC活性與沉淀中PC活性之和。
按樣本鮮重計(jì)算：PC總活性（U/g 鮮重）=666.67×y上清÷W+ 666.67×y沉淀÷W
=666.67×（y上清+y沉淀）÷W
（2）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol 無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位U。
上清中PC活性的計(jì)算：
PC上清活性(U/104 cell)= (y上清×V酶促×106)÷(V樣÷V提取×500)÷T=1.33×y上清
沉淀中PC活性的計(jì)算:
PC沉淀活性(U/104 cell)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V樣÷V重懸×500)÷T=1.33×y沉淀
樣本PC總活性的計(jì)算：
樣本PC總活性即為上清中PC活性與沉淀中PC活性之和。
按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：PC總活性（U/104 cell）=1.33×y上清+1.33×y沉淀=1.33×（y上清+y沉淀）
（3）按樣本蛋白濃度
單位的定義：每毫克組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位U。
上清中PC活性的計(jì)算：
PC上清活性(U/mg prot)= (y上清×V酶促×106)÷Cpr×V樣)÷T=666.67×y上清÷Cpr
沉淀中PC活性的計(jì)算:
PC沉淀活性(U/mg prot)=(y沉淀×V酶促×106)÷(Cpr×V樣)÷T=666.67×y沉淀÷Cpr
樣本PC總活性的計(jì)算：
樣本PC總活性即為上清中PC活性與沉淀中PC活性之和。
按樣本鮮重計(jì)算：PC總活性（U/g 鮮重）=666.67×y上清÷Cpr+ 666.67×y沉淀÷Cpr
=666.67×（y上清+y沉淀）÷Cpr
V酶促：酶促反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；106：單位換算系數(shù)，1mmol=106nmol；V樣：加入樣本體積，0.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；V提取：提取體系體積，1mL ；W：樣本重量，g；V重懸：重懸沉淀體積，1mL；500：細(xì)胞總數(shù)，500萬；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。
典型標(biāo)準(zhǔn)曲線-以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
更新中...
可能原因 解決措施是
1，酶標(biāo)儀設(shè)置不正確 檢查儀器波長
2，沒加終止液 加入適量終止液
3，讀板時(shí)等待時(shí)間太長 及時(shí)讀板
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