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總氧化狀態(TOS)是指生物體內所有抗氧化物質與氧化物質的動態平衡狀態。TOS反映了生物體內氧化應激的水平，是評估氧化損傷和抗氧化能力的重要指標?。本試劑盒提供了一種簡單易用的方法，用于測量各種生物樣本的TOS。原理是在酸性條件下，樣本中的氧化性物質可將二價鐵離子氧化為三價鐵離子，后者與二甲酚橙結合產生一種藍紫色的復合物，在580nm有大吸收峰。通過測定580nm吸光度變化可以間接測定樣本的總氧化狀態。

酶標儀或可見分光光度計（能測 580nm處的吸光度）

 96孔板或微量玻璃比色皿、可調節式移液槍及槍頭

恒溫箱、離心機、制冰機

去離子水

勻漿器（如果是組織樣本）

10kDa的超濾管（用來去除蛋白）

注意：各組分（小管試劑）開蓋前，請先低速離心。

提取液：即用型；4℃保存。

顯色物：即用型；使用前，平衡到室溫；整個實驗過程中，避光放置；4℃避光保存。

H₂O₂標準品(1M)：即用型；使用前，平衡到室溫；整個實驗過程中，避光放置；4℃避光保存。

標準曲線設置：

先配制2mM H₂O₂標準品：取2μL H₂O₂標準品(1M)加998μL 提取液稀釋；

再配制200μM H₂O₂標準品：取50μL 2mM的H₂O₂標準品加入450μL提取液稀釋。

使用200μM H₂O₂標準品，按照下表所示，進一步稀釋標準品。

注意：每次實驗，請使用新配制的標準品；配制好的標準品需要在4h之內使用；如果樣本是細胞懸浮液，建議使用培養基配制H₂O₂標準品。

動植物組織：稱取 0.1g組織，加入1mL預冷的提取液，冰上勻漿。12,000g，4℃離心10min，取上清液待測。

細胞和細菌樣本的制備：收集5×10⁶個細胞或細菌，用冷PBS清洗細胞或細菌后棄上清，加入 1mL預冷的提取液冰上勻漿。12,000g，4℃離心10min，取上清液待測。

血清、血漿、尿液（和其它生物學液體）：直接測定。

為了消除蛋白可能造成的干擾，可以對處理好的樣本進行去除蛋白的處理。

去除蛋白的方式：使用10kDa的超濾管過濾后取濾液。

注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存6個月。如下物質會干擾檢測結果，樣本中應避免存在：Ferric salts, iron salts, sucrose, glucose, ascorbic acid, SDS (>0.2%), sodium azide。

1．酶標儀或可見分光光度計預熱30min 以上，調節波長到580nm，可見分光光度計用去離子水調零。

2．在 96 孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加樣：

3. 充分混勻，37℃孵育10min，讀取580nm處的吸光值，記為 A_空、A_標、A_測，計算ΔA_標=A_標-A_空、ΔA_測=A_測-A_空（空白孔只需測定1次）。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA_測小于0.005可適當加大樣本量。如果ΔA_測大于0.5，樣本可用去離子水進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數。

1. 標準曲線的繪制 以標準液濃度為y軸，ΔA_標為x軸，繪制標準曲線（濃度為y軸更方便計算結果）。將ΔA_測代入公式計算出y(1μM=1nmol/mL)。

2. 樣本TOS計算

（1）按樣本鮮重計算 TOS(nmol H₂O₂/g 鮮重)=y×V_樣÷(W×V_樣÷V_樣總)×n=y÷W×n

（2）按樣本體積計算 TOS(nmol H₂O₂/mL)=y×V_樣÷V_樣×n=y×n

（3）按細胞或細菌數量計算 TOS(nmol H₂O₂/10⁴ Cell)=y×V_樣÷(細胞或細菌數量×V_樣÷V_樣總)×n=y÷500×n

V_樣：加入樣本體積，0.06mL；W：樣本質量，0.1g；V_樣總：樣本制備時加入提取液體積，1mL；n：樣本稀釋倍數；500：細胞或細菌數量，500萬。

典型標準曲線-以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。