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肌酐（creatinine，Cr）是肌肉在人體內代謝的產物，主要由腎小球濾過排出體外。血中的肌酐來源包括外源性和內源性兩部分。外源性肌酐是肉類食物在體內代謝后的產物；內源性肌酐是體內肌肉組織代謝的產物。血肌酐幾乎全部經腎小球濾過進入原尿，并且不被腎小管重吸收；內源性肌酐每日生成量幾乎保持恒定，嚴格控制外源性肌酐的攝入時，血肌酐濃度為穩定值，因此，測定血肌酐濃度可以反映腎小球的濾過功能。本試劑盒提供了一種簡單易用的比色法，用于檢測樣本中肌酐含量。其原理是：肌酐酶可催化肌酐產生肌酸，肌酸酶催化肌酸產生肌氨酸和尿素。肌氨酸在肌氨酸氧化酶的催化下氧化產生過氧化氫，過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯酚，生成紅色醌類化合物；在500nm有特征吸收峰。測500nm處的吸光值，即可測定樣品中肌酐含量。

酶標儀或可見分光光度計（能測500nm處的吸光度）

恒溫箱、制冰機、低溫離心機

96孔板或微量玻璃比色皿、可調節式移液槍及槍頭

提取液：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。

試劑一：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。

試劑二：臨用前96T加入5mL 試劑三，48T加入2.5mL 試劑三充分混勻待用。用不完的試劑可4℃保存一周或分裝后-20℃保存，避免反復凍融。

試劑三：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。

工作液的配制：每孔配制200μL工作液：吸取50μL溶解后的試劑二，150μL 試劑一。工作液需現配現用，根據需要測定的樣本數按比例配制。

標準品：含10 mg肌酐，臨用前加入1mL去離子水溶解得10 mg/mL標準品。溶解后的標準品可4℃保存1個月或分裝-20℃長期保存。

標準曲線設置：按下表所示，用去離子水將10mg/mL標準品稀釋為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的標準溶液。

注意：每次實驗，請使用新配制的標準品。

動物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液，冰浴勻漿，12,000g，4℃離心10min，取上清液待測。

細胞或細菌：收集500萬細胞或細菌到離心管內，用冷PBS清洗細胞或細菌，離心后棄上清，加入1mL提取液，冰浴超聲波破碎細胞5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次），然后12,000g，4℃離心10min，取上清待測。

血清（漿）、尿液等液體樣本：直接測定。

注意：推薦使用新鮮血清樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存6個月。如需測定蛋白濃度，推薦使用BCA蛋白質定量試劑盒進行樣本蛋白質濃度測定。

1. 酶標儀或可見分光光度計預熱30min以上，調節波長到500nm，可見分光光度計去離子水調零；恒溫箱預熱到37℃。

2. 樣本測定（在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列試劑）：

混勻，37℃靜置60min，測定500nm 處吸光值A。空白孔記為A_空，標準孔記為A_標，測定孔記為A_測，對照孔記為A_對。計算ΔA_測=A_測-A_對，ΔA_標=A_標-A_空。

注意：實驗之前建議選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA小于0.005可適當加大樣本量。如果ΔA大于 1.0，樣本可用提取液適當稀釋，計算結果乘以稀釋倍數，或減少提取用樣本量。

1. 標準曲線的繪制

以標準液濃度為y軸，ΔA_標為x軸，繪制標準曲線（濃度為y軸更方便計算結果）。將ΔA_測帶入方程得到y值（mg/mL）。

2. 肌酐含量計算

1）按照樣本鮮重計算

肌酐含量（mg/g 鮮重）=y×V_樣÷(W×V_樣÷V_樣總)×n=y÷W×n

2）按照細菌或細胞數量計算

肌酐含量（mg/10⁴ cell）=y×V_樣÷(細胞數量×V_樣÷V_樣總)×n=y÷500×n=0.002×y×n

3）按照液體體積計算

肌酐含量（mg/mL）=y×V_樣÷V_樣×n=y×n

4）按照蛋白濃度計算

肌酐含量（mg/mg prot）= y×V_樣÷(V_樣×Cpr) ×n=y÷Cpr×n

V_樣：加入樣本體積，0.02mL；W：樣本質量，g；V_樣總：加入提取液體積，1mL；n：樣本稀釋倍數； Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；500：細胞數量，500萬。

典型標準曲線