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活細菌/死細菌雙染試劑盒(SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit)是一款方便且操作簡單的試劑盒，利用SYTO9綠色核酸染料和碘化丙啶(PI)紅色熒光核酸染料來進行細菌活力的檢測，適用于大量的細菌種屬，包括蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產氣莢膜桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、草分枝桿菌、綠膿桿菌、金黃葡萄球菌、奧拉尼堡沙門氏菌、宋內志賀氏菌和化膿性鏈球菌。

本試劑盒的工作原理在于SYTO 9和PI的光譜特征以及穿透健康細菌細胞的能力不同。單獨使用時，SYTO 9能對群體內的所有細菌進行標記一具有完整膜和受損膜的細菌;相反，PI只能滲透進入受損的膜，PI的插入會引起SYTO 9染色熒光的降低，當體系內加入兩種染料時。因此，通過適量比例的SYTO 9和PI的混合染色，具有完整膜結構的細菌呈綠色熒光，而具受損膜結構的細菌呈紅色熒光。兩者染料的大激發和發射波長分別是480/500nm(SYTO 9)和490/635nm(PI)，背景基本無熒光。本試劑盒兼容于熒光顯微鏡，熒光光度計、熒光酶標儀，流式細胞儀或其它熒光檢測儀器。

以下步驟僅用作示例以指導科研人員開展自身細菌樣本的染色。

一、培養條件和細菌懸液的制備

注意:用本試劑盒進行細菌染色，務必要小心去除培養基殘留，因為，核酸和其它培養基成分可能以不可預料的方式與SYTO 9和PI結合，導致染色結果發生不可接受的變動。簡單的一次清洗步驟通常足以去除培養基內含的培養基成分干擾物殘留。不建議使用磷酸鹽清洗緩沖液，因此可能降低染色效率。

1.1 用營養肉湯培養大腸桿菌或金黃色葡萄球菌(30ml) 使其生長至對數生長后期。

1.2 于10000xg離心10-15min，濃縮25ml細菌培養物。

1.3 吸走上清液，用2ml 0.85% NaCI或適當緩)中液來重懸沉淀。

1.4 取1ml重懸菌液分別加入含20ml 0.85% NaCI或適當緩)沖液的30-40ml商心管(用作活細菌)，或含20ml70%異丙醇的30-40ml離心管(用作殺死細菌).

1.5 兩管樣品于室溫孵育1h，每隔15min顛倒混勻一次。

1.6 兩管樣品于10000xg離心10-15min。

1.7 用20ml 0.85% NaCI或適當緩沖液重懸沉淀，并且按照步驟1.6再離心一次。

1.8分別用10ml 0.85% NaCI或適當緩沖液重懸兩管樣品。

1.9 分別取3ml菌液測定670nm的光密度(OD670)，用玻璃或丙烯酸酯比色皿(1cm路徑).

1.10 對于大腸桿菌或金黃色葡萄球菌的建議染色濃度，根據你的儀器類型(熒光顯微鏡、熒光光度經、熒光酶標儀)或流式細胞儀來參考相應部分的染色條件。

二、染色條件的優化

試劑盒內的兩種染料都經過平衡優化，按照1:1的比例進行混合用于絕大多數的樣本都能得到良好的區分活/死細菌。偶然情況下，兩種染料的混合比例需根據實際需求進行優化調整。比如:在待檢樣本中，綠色熒光太突出，建議要么降低SYTO 9濃度，要么提高PI濃度。為了全面優化染色條件，建議測試梯度濃度的SYTO9，每一種濃度與梯度濃度的PI進行組合染色。建議按照1ml細菌懸液加入3μl不同混合比率的染料預混液。

三、熒光顯微鏡操作步驟

活菌和死菌的熒光可能用標準的熒光素長通濾片設置來同時觀察。替代方案的話，活菌(綠色熒光)和死菌(紅色熒光)可分別用熒光素和Texas Red帶通濾光片設置。

3.1 在微量離心管內組合等量的組分A(SYTO 9)和組分B (PI)，混勻。

3.2 每1ml細菌懸液內加入3μl染料預混液。按照建議的稀釋倍數，終得到的染色工作液內含0.3% DMSO，更高濃度的DMSO可能對染色產生副效果。

3.3 混勻后室溫避光孵育15min。

3.4 吸5μl染色的細菌懸液到載玻片上，并蓋上18mm方形蓋玻片。

3.5 根據表1選擇熒光顯微鏡上合適的濾片來觀察。

四、熒光光度計操作步驟

4.1調整大腸桿菌懸液(活和殺死)使其密度為1x10⁸個細菌/ml (~0.03 OD670)或金黃色葡萄球菌懸液(活和殺死)使其密度為1x10⁷個細菌/ml (~0.15 OD670)。用于熒光光度計檢測，金黃色葡萄球菌懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍。

4.2 參考表1在1cm 玻璃、丙烯酸酯或石英熒光比色皿混勻五種不同比例的細菌懸液。每個樣本的總體積為3ml。

表1.熒光光度計法檢測活/死細菌所需不同比例活細菌和死細菌縣液的加量體積

4.3 在微量離心管內分別加30ul組分A(SYTO 9) 和30ul組分B (PI)，混勻。

4.4 每組不同比例的細菌懸液內加入9μl染料預混液(5個樣本x9μl =45μl總量)，用槍上下吹打數次使其混勻。

4.5 室溫避光孵育15min。

4.6熒光測定和數據分析

①用熒光光度計測定每組細菌懸液(Fcell) 的熒光發射光譜(激發:470nm，發射:490-700nm);

②分別測定發射光譜在510-540nm (em1，綠色)和620-650nm (em2，紅色)的累積熒光，并計算累積熒光比值:RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

③以大腸桿菌懸液內活細胞的占比為橫坐標，以累積綠色熒光與紅色熒光比(RatioG/R)為縱坐標，制圖。

五、熒光酶標儀操作步驟

針對細菌懸液，用熒光酶標儀的測定條件與熒光光度計的基本類似。如同熒光光度計的檢測步驟，染料濃度相同于熒光顯微鏡的建議濃度，綠/紅熒光比與活細菌相對數量呈正比。

5.1 調整大腸桿菌懸液(活和殺死)使其密度為2x10⁸個細菌/ml(~0.06 OD670)或金黃色葡萄球菌懸液(活和殺死)使其密度為2x10⁷個細菌/ml(~0.3 OD670)。用于熒光酶標儀檢測，金黃色葡萄球菌懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍。

5.2 參考表2在16x125mm高硼硅玻璃培養管內混勻五種不同比例的細菌懸液(大腸桿菌或金黃色葡萄球菌)。每個樣本的總體積為2ml。

表2.熒光酶標儀法檢測活/死細菌所需不同比例活細菌和死細菌懸液的加量體積

5.3 在微量離心管內分別加6ul組分A(SYTO 9) 和6ul組分B(PI)，混勻。

5.4 通過將所有的12μl上述預混液加入2ml無菌的dH2O，混勻后制備2x染色混合液。

5.5 吸100ul細菌懸液混合物到平底96孔板的各孔內，建議每個制備物做三個平行。96孔板的邊緣孔通常空置以避免假讀數。

5.6更換新的槍頭，每孔加入100μl 2x染色混合液，上下吹打使充分混勻。

5.7 室溫避光孵育15min。

5.8熒光測定和數據分析

①以~485nm為激發波長，~530nm為發射波長(emission 1，綠色)來測定每孔熒光;

②以~485nm為激發波長，~630nm為發射波長(emission 2，紅色)來測定每孔熒光;

③通過測定兩種發射波長下的熒光強光，并計算熒光比值:RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

④以大腸桿菌懸液內活細胞的占比為橫坐標，以RatioG/R為縱坐標，制圖。

1)由于試劑盒內SYTO 9和PI的組分量少，室溫回溫充分融化后，務必低速離心沉至管底后再開蓋。

2) 次使用可將SYTO 9和PI根據單次用量分裝保存，密封后置于≤-20℃避光保存。

3)組分C(Mounting oil)用于將細菌固定在膜上，25℃的折射率是1.517±0.003。不要用作浸油(lmmersion oil).

4) SYTO 9和PI結合核酸，PI是潛在的誘變劑，目前沒有數據闡明SYTO 9的誘變性或毒性，兩種試劑使用都需做恰當防護。DMSO能促進有機分子進入組織。強烈

建議處理DMSO儲存液時戴雙層手套。對于核酸染料，含此類染料的試劑經活性炭吸附后再進行廢液處理。活性炭之后經焚燒來破壞染料。

5) 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。