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Western Blot（WB）實驗中膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個問題，那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。
1、二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；
2、ECL底物中H2O2不穩定，失活；
3、ECL底物沒覆蓋到相應位置；
4、一抗選擇不當；
5、二抗失活。
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Western Blot（WB）實驗中背景高咋回事?
答：可能的原因有：
1、膜沒有完全均勻濕透,建議 使用100% methanol浸透膜；
2、洗膜不充分，可以增加洗液體積和洗滌次數；
3、電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調整電極和加樣；
4、封閉物用量不足，可以提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉印膜；
5、封閉物使用不當，比如檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉；
6、封閉時間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時以上或者4度封閉過夜；
7、抗體非特異性結合，可以降低抗體濃度，減少孵育時間；
8、一抗稀釋度不適宜，可以對抗體進行滴度測試，選擇適宜的抗體稀釋度；
9、一抗孵育的溫度偏高，建議4℃結合過夜；
10、抗體濃度過高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數和時間；
11、化學顯色底物過多，建議按說明書加入適量的顯色底物。
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Western Blot（WB）實驗中為啥條帶形狀不好看？
答：可能的原因有：
1、膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻；
2、某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或將樣品鹽濃度調成一致；
3、緩沖液陳舊，成分改變,可以重配；
4、凝膠下面有氣泡,電泳前要先將氣泡趕走；
5、電泳時溫度過高，可以降低電流或電壓；
6、樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分攪拌混勻。
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Western Blot（WB）實驗中蛋白條帶位置（大小）不對咋整？
答：可能的原因有：
1、膠濃度不對，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調整濃度；
2、抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長孵育時間；
3、酶失活，建議直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物；
4、目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關文獻確定；
5、標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設置陽性對照比對結果，增加標本上樣量。
