脂質(zhì)(Lipid)是中性脂肪、類脂及其衍生物的總稱，其共同的物理特性是不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑(如乙醇、乙醚等)。人體的脂肪主要有兩種：1、儲(chǔ)存脂肪，如中性脂肪，主要分布于皮下、腎、胰腺等部位。2、結(jié)構(gòu)脂肪，如類脂(磷脂、糖脂、膽固醇等)，主要分布于細(xì)胞內(nèi)。中性脂肪(Neutral fat)是由三分子脂肪酸和一分子甘油組成的脂類，呈中性。中性脂肪是儲(chǔ)存能量的方式之一，在氧化時(shí)釋放出能量。中性脂肪染色經(jīng)常采用蘇丹Ⅱ、蘇丹Ⅲ、蘇丹Ⅳ、蘇丹黑B、油紅O法等。傳統(tǒng)方法采用蘇丹染料，近發(fā)現(xiàn)偶氮染料油紅O更適合脂肪的染色。油紅O是很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，較易與甘油三脂結(jié)合呈小脂滴狀，與磷脂結(jié)合力稍差，其染色原理一般認(rèn)為是物理上的溶液作用或吸附作用，借溶液作用使脂肪染色。染料在細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的溶解度較原溶劑中的溶解度更大，所以在染色時(shí)染料就從有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)移入脂質(zhì)而使脂肪染色。
油紅O染色液(細(xì)胞專用)簡(jiǎn)稱ORO染色液，可顯示小的脂滴，可優(yōu)先為脂類從溶劑中吸附染料。標(biāo)本不采用含有乙醇的固定液，如需要固定可采用10%福爾馬林)。脂肪陽性染色結(jié)果呈橘黃至紅色，但具體顏色因脂質(zhì)濃度而定。
1、 冰凍切片厚度 6～10um，不固定或10%福爾馬林固定10min后水洗，蒸餾水稍沖洗。
2、 入油紅O染色洗滌液清洗20～30s。
3、 入改良油紅O染色液(加蓋)，密閉染色10～15min。
4、 入油紅O染色洗滌液漂洗20～30s以便去除染液，蒸餾水稍微清洗。
5、 入 蘇木素染色液，復(fù)染核2～5min，自來水漂洗10min至核為藍(lán)色。(選做)
6、 蒸餾水稍微清洗，濾紙吸干周圍水分。
7、 水溶性封固劑(甘油明膠或阿拉伯糖膠)封固，鏡檢。
1、 由于脂肪易溶于有機(jī)溶劑，組織不能采用含有機(jī)溶劑的固定液(如需要固定可采用10%福爾馬林)，亦不采用石蠟切片，需用冰凍切片或碳蠟切片。
2、 作脂肪染色的冰凍切片不可太薄，過薄的切片常會(huì)使脂質(zhì)丟失。
3、 改良油紅O染色液易產(chǎn)生沉淀，影響染色觀察，可采用靜置20～40min或3000rpm 離心10分鐘取上清備用。
4、 蘇木素染色液復(fù)染時(shí)間不能過長(zhǎng)。
5、 染色結(jié)果不能長(zhǎng)期保存，應(yīng)盡快觀察及照相。
6、 水溶性封固劑封固的樣本保存時(shí)間不長(zhǎng)；如需長(zhǎng)期保存，可以在蓋玻片與載玻片交界的邊緣用中性樹膠封閉。
7、 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
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答：可能的原因有：
1、目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)，本身可以呈現(xiàn)多條帶，建議查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小；
2、樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作；
3、雜蛋白多，建議處理目的蛋白；
4、抗體特異性不強(qiáng)，建議使用特異性強(qiáng)的抗體；
5、抗體孵育時(shí)間過久，建議減少抗體孵育時(shí)間；
6、二抗與抗原有交叉反應(yīng)，建議選擇合適的封閉物；
7、二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度；
8、底物顯色與曝光時(shí)間過長(zhǎng)，建議縮短顯色及曝光的時(shí)間。
答：可能的原因有：
1、膠濃度不對(duì)，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調(diào)整濃度；
2、抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間；
3、酶失活，建議直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物；
4、目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關(guān)文獻(xiàn)確定；
5、標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設(shè)置陽性對(duì)照比對(duì)結(jié)果，增加標(biāo)本上樣量。
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