固定的目的在于保存細(xì)胞和組織的原有形態(tài)結(jié)構(gòu)，固定劑能阻止內(nèi)源性溶酶體酶對(duì)自身組織和細(xì)胞的自溶、抑制細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)。固定劑通過凝固、生成添加化合物等使蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使酶失活。固定劑對(duì)細(xì)胞核細(xì)胞外成分發(fā)生物理改變。固定液主要分為醛類固定液、汞類固定液、醇類固定液、氧化劑類固定液、苦味酸鹽類固定液等，較為常用的是醛類中的福爾馬林、醇類中的乙醇。
福爾馬林固定液(10%)主要由甲醛、去離子水組成，該固定液適合于絕大多數(shù)組織的固定。
1、按實(shí)驗(yàn)具體要求操作。一般標(biāo)本固定時(shí)間控制在1～4h，大標(biāo)本應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)固定時(shí)間。
2、固定好的組織，可在福爾馬林固定液(10%)或70%乙醇中長(zhǎng)期保存。
福爾馬林固定液(10%)有一定刺激性和腐蝕性，請(qǐng)?jiān)谕L(fēng)較好的環(huán)境下操作， 避免吸入。
固定液pH好接近用中性，pH范圍6～8。
組織取材的厚度不同，固定時(shí)間也不同。常規(guī)活檢組織比較適合的厚度為2～4mm，一般不超過6mm。對(duì)組織恰當(dāng)?shù)倪x材有利于固定液的滲透。
固定液的容量應(yīng)足夠，一般固定液與組織塊的體積比率應(yīng)大于10:1。如果容積不夠大，可以在固定期間更換1～3次固定液。
溫度對(duì)固定的影響很明顯，提高溫度可以加速固定作用，但溫度不宜過高。
取出新鮮組織后，應(yīng)及時(shí)固定，無法及時(shí)固定時(shí)，應(yīng)保存于生理鹽水中及時(shí)送檢。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
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答：可能的原因有：
1、IHC實(shí)驗(yàn)一抗和二抗不兼容；
2、沒有足夠的一抗與目的蛋白結(jié)合；
3、抗體可能不適用于IHC，因?yàn)槠淇赡軣o法識(shí)別蛋白的天然(3D)形式；
4、一抗/二抗/信號(hào)放大試劑盒可能因儲(chǔ)存不當(dāng)、稀釋不當(dāng)或多次反復(fù)凍融而失去活性；
5、該蛋白不存在于目標(biāo)組織中；
6、目的蛋白在組織中含量并不豐富；
7、二抗未避光保存（進(jìn)行熒光檢測(cè)時(shí)）；
8、脫蠟可能不充分；
9、固定步驟可能會(huì)改變抗體識(shí)別的抗原表位；
10、抗體不能穿透蛋白所定位的細(xì)胞核（核蛋白）；
11、PBS緩沖液被細(xì)菌污染，細(xì)菌會(huì)破壞目的蛋白上的磷酸基團(tuán)（磷酸化蛋白）；
12、抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合。
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