DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染料是一族親脂性的熒光染料，可以用來染細胞膜和其它脂溶性生物結構。當與細胞膜結合后其熒光強度大大增強，這類染料有著很高的淬滅常數和激發態壽命。一旦對細胞染色，這類染料在整個細胞膜上擴散，佳濃度時可以使整個細胞膜染色。它們的熒光顏色區分明顯：DiI（橙色熒光），DiO（綠色熒光），DiD（紅色熒光）和 DiR （深紅色熒光）這使得他們可以用來對活細胞進行多色成像和流式分析。DiI和DiO可以分別用標準的 FITC和TRITC的濾光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激發，有著比DiI更長的激發波長和發射波長，在細胞和組織染色中更有價值。 DiR的紅外熒光可以穿透細胞和組織，在活體成像中用來示蹤。
1. DiD，DiO，DiI，DiR和DiS細胞膜染色液制備
（1）配置DMSO或EtOH 儲存液：儲存液用 DMSO或EtOH配置濃度1～5 mM。
注意：未使用的儲存液保存在-20°C，避免反復凍融。
（2）工作液制備：用合適的緩沖液（如：無血清培養基，HBSS或PBS）稀釋儲存液，配制濃度為1～5 μM的工作液。
注意：工作液的終濃度是根據不同細胞和實驗的經驗來配制。可以從推薦濃度的十倍以上尋找佳條件。?
2. 懸浮細胞染色
（1）懸浮細胞密度為 1 × 106/mL加入到工作液中。
（2）在37 ℃培養細胞 2～20分鐘，不同的細胞佳培養時間不同。
（3）染色細胞試管在1000～1500轉離心5分鐘。
（4）傾倒上清液，再次緩慢加入預溫37℃的培養液。
（5）重復（3），（4）步驟兩次以上。
3. 粘壁細胞的染色
（1）使粘壁的細胞在無菌實驗室培養。
（2）從培養基中移走蓋玻片，吸走過量培養液，將蓋玻片放在潮濕的環境中。
（3）在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。
（4）在37 ℃培養細胞 2～20分鐘，不同的細胞佳培養時間不同。
（5）吸干染料工作液，用培養液洗蓋玻片2～3次，每次用預溫的培養基覆蓋所有細胞，培養5～10分鐘，然后吸干培養基。
4. 顯微鏡檢測
選擇合適的DiD，DiO，DiI，DiR和DiS濾光器。
5. 流式細胞儀的檢測
DiD，DiO，DiI，DiR和DiS 染色的細胞可以分別用經典的FL1，FL2，FL3和FL4流式細胞儀檢測。
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答：可能的原因包括培養基質量、血清質量、溫度、pH值、氣體比例等。
解決方法有：
1. 使用高質量的培養基和血清，確保其無菌、無支原體污染，并保證在保質期內使用；
2. 培養箱溫度和氣體比例要保持穩定，定期校準；
3. 每天檢查并記錄細胞培養的環境參數，如溫度、pH值、氣體比例等，以便及時發現問題；
4. 定期更換培養基，保持細胞營養充足；
5. 對于生長緩慢的細胞株，可以嘗試進行克隆篩選或更換培養基。
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