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磷脂酰絲氨酸（PS）是一種帶負電荷的磷脂，正常細胞中，PS只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜PS由脂膜內側翻向細胞膜外側，使PS暴露在細胞膜外表面。AnnexinV是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此AnnexinV被公認為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。

將Annexin V進行紅色熒光SuperFluor647標記，以標記了的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此采用AnnexinV與PI雙染的方法，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限是凋亡晚期細胞和壞死細胞。

1. 細胞樣品的準備：

a)懸浮細胞：

1)收集細胞至離心管中1000-2000rpm離心5min，小心去除上清。

2)用1ml 4℃預冷PBS輕輕重懸細胞并計數，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

3)再加入1ml 4℃預冷的PBS重懸細胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

b)貼壁細胞：

1）吸出細胞培養液至離心管中，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量不含EDTA的胰酶細胞消化液消化細胞。

2）室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。

3）加入步驟1中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離心管內，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

注：加入步驟1中的細胞培養液一方面可以收集已經懸浮的發生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續加入的Annexin V-Super Fluor647導致染色失敗。

4）用1ml 4℃預冷PBS輕輕重懸細胞并計數，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

5）再加入1ml 4℃預冷的PBS重懸細胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

2. 用去離子水按1：4稀釋Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml去離子水）；

3. 用250ml結合緩沖液重新懸浮細胞，調節其濃度為1×10⁶/ml；

4. 取100ml的細胞懸液于5ml流式管中，加入Annexin V-Super Fluor647，輕輕混勻；

5. 室溫(20-25℃)避光孵育10min；

6. 上機前5min加入10ml碘化丙啶溶液，輕輕混勻；

7. 上機前在反應管中補加400ml PBS重懸細胞，避光保存，隨即進行流式細胞儀（FACS）檢測，Annexin V-Alexa Fluor647和PI均為紅色熒光。

1)所有產品僅限用于研發，必須生物技術人員操作同時佩戴口罩/手套/實驗服并遵守生物實驗室安全操作規程！

2)微量試劑需離心數秒將試劑收集至管底后再開蓋取用。

3)Propidium Iodide（PI）有毒，操作時要帶手套，使用時避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。

4)Annexin V-Super Fluor647中含有劇毒成分疊氮化鈉（NaN₃）,操作時要帶手套，使用時避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。

5)本試劑盒用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不應低于1x10^⁶。

6)染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。

7)Annixin V檢測凋亡細胞的方法適用于懸浮生長的細胞，如：淋巴細胞等細胞的檢測。對于貼壁生長的細胞，由于在胰酶等消化處理過程中會造成細胞膜的損傷，會造成較高的假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，而影響檢測，可將胰酶消化后的細胞保存在含2%BSA的PBS中，防止進一步的損傷。盡管目前，包括國外也有一些單位采用該方法檢測貼壁生長的細胞。不推薦用該方法檢測，因為其重復性較差，且需要操作時非常小心。

8)消化貼壁細胞殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-Super Fluor647，終導致染色失敗。

9)細胞固定后可能導致熒光的淬滅，請不要固定樣品。