增強型BCA蛋白定量試劑盒的原理是蛋白質分子中肽鍵結構在堿性條件下將二價銅離子還原為一 價銅離子，一價銅離子與BCA分子形成紫色絡合物。此絡合物可用540 -590nm波長檢測，并在562nm處有大 的光吸收值 。反應物的顏色和蛋白質濃度在一定范圍內具有線性關系，故可以根據吸光度值的大小來測定蛋 白的含量 。該方法快速靈敏 、穩定可靠，對不同種類蛋白質檢測的變異系數非常小 ，倍受專業人士青睞。 BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響，在組織細胞裂解實驗中，對于5%濃度以內的去 垢劑SDS ，TritonX- 100 ，Tween20 ，Tween80具有很好的兼容性，但易受螯合劑(EDTA，EGTA) 、還原劑(DTT、 巰基乙醇)和脂類的影響。每個試劑盒少可以檢測500個樣品。
室溫保存，蛋白標準品-20℃保存，一年內有效。
檢測范圍：在0.025-2mg/ml濃度范圍內有較好的線性關系。
檢測靈敏度：檢測濃度下限為25ug/mL 。
1、BCA試劑在低溫條件下出現結晶沉淀時，可37℃溫浴使其溶解，不影響使用。
2、待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中 ，蛋白標準品也宜溶解于什么樣的稀釋液中 ， 否則待測蛋白與蛋白標準品中所含非蛋白成分不一致 ，有可能導致測定不準確。
3、待測蛋白和蛋白標準品加入BCA工作液后 ，若發現檢測效果不佳 ，可以室溫放置2h 或60 ℃放置30 min ，顏色會隨著時間的延長不斷加深 ， 并且顯色反應也會隨溫度升高而加快 。如果待測蛋白濃度較低 ，可以適當延長孵育時間或在較高溫度下孵育 ，但是切勿過熱 ， 否則易失效。
4、建議每次測定時都做標準曲線 。 因為BCA法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深 ， 并且顯色反應的速度和溫度有關 ，所以除非精確控制顯色反應的時間和溫度 ， 否則如需精確測定需每次都做標準曲線 。要想得到更為精確的蛋白濃度結果 ，建議每個蛋白標曲梯度和樣品均做復孔。
5、如發現樣品稀釋液或裂解液本身就有較高背景 ，請試用Bradford 蛋白定量試劑盒（PMK0443 ）。
6、本試劑盒受螯合劑和略高濃度的還原劑影響 ， 需確保EDTA低于10 mM ，無EGTA ，二硫蘇糖醇（DTT）低于1mM ， β - 巰基乙醇低于0 .01% ，不適用BCA法時建議試用Bradford蛋白定量試劑盒（PMK0443 ）。
7、如果沒有酶標儀 ，也可以使用普通的分光光度計測定 ，但測定時 ， 需根據比色皿的小檢測體積 ，按比例 適當加大BCA工作液的用量使總體積不小于小檢測體積 ，樣品和標準品的用量亦相應按比例放大 。使用分光光度計測定蛋白濃度時 ，每個試劑盒可以測定的樣品數量可能會顯著減少。
8、本產品僅限于專業人員的科學研究用 ，不得用于臨床診斷或治療 ，不得用于食品或藥品 ，不得存放于普通住宅內。
9、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
1.Zhoujia H ,Wei Z ,Lin H , et al.Kaempferol exerts antioxidant effects in age-related diminished ovarian reserve by regulating the HSP90/NRF2 pathway.[J].Chemical biology & drug design,2023,103(1):(IF 3)
答：可能的原因有：
1、目的蛋白有多個修飾位點，本身可以呈現多條帶，建議查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小；
2、樣本處理過程中目的蛋白發生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作；
3、雜蛋白多，建議處理目的蛋白；
4、抗體特異性不強，建議使用特異性強的抗體；
5、抗體孵育時間過久，建議減少抗體孵育時間；
6、二抗與抗原有交叉反應，建議選擇合適的封閉物；
7、二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質變性過程及強度；
8、底物顯色與曝光時間過長，建議縮短顯色及曝光的時間。
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