目前世界上常用的蛋白濃度檢測方法是：BCA 蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)和Bradford蛋白定量試劑盒(Bradford Protein Assay Kit)。Bradford法與傳統方法相比，更簡單、更穩定、兼容性更好。
Bradford法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響。樣品中β-巰基乙醇的濃度可高達1M，DTT的濃度可高達5mM。但受高濃度的去垢劑的影響明顯，故在用Bradford蛋白定量試劑盒進行蛋白定量時，需確保SDS低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween20,60,80低于0.015%。含高濃度去污劑的蛋白定量，建議采用BCA蛋白定量試劑盒。
Bradford蛋白定量試劑盒主要由G250、緩沖液等組成，檢測速度很快，少量樣品一般只需10min即可完成檢測。檢測濃度下限達到25ug/ml，小檢測蛋白量達到0.5ug，待測樣品體積為1～20ul。在50~1000ug/ml濃度范圍內有較好的線性關系。
1、考馬斯亮藍G250溶液使用前請顛倒3-5次，混勻。
2、蛋白標準請在全部溶解后先混勻，再稀釋成一系列不同濃度的蛋白標準品。
3、將考馬斯亮藍G250溶液回復到室溫再使用，有利于提高檢測的靈敏。
4、Bradford法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響。樣品中β巰基乙醇的濃度可高達1M，二硫蘇糖醇的濃度可高達5mM。但受略高濃度的去垢劑影響。需確保SDS低于0.01%，TritonX-100低于0.05%，Tween20,60,80低于0.015%。含去垢劑的樣品推薦使用本公司生產的BCA蛋白濃度測定試劑盒（PMK0442）。染色時間不能太長，否則活細胞會因染料積累而染成顏色，使檢測結果偏低。
5、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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答：可能的原因有：
1、目的蛋白有多個修飾位點，本身可以呈現多條帶，建議查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小；
2、樣本處理過程中目的蛋白發生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作；
3、雜蛋白多，建議處理目的蛋白；
4、抗體特異性不強，建議使用特異性強的抗體；
5、抗體孵育時間過久，建議減少抗體孵育時間；
6、二抗與抗原有交叉反應，建議選擇合適的封閉物；
7、二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質變性過程及強度；
8、底物顯色與曝光時間過長，建議縮短顯色及曝光的時間。
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