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菁染料是性能優良的熒光標記染料，摩爾吸光系數在熒光染料中是高的，其琥珀酰亞胺酯是常用的脂肪氨基標記試劑，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標記和檢測。通過改變次甲基鏈的長度,?可改變其熒光發射波長，每增加一個雙鍵，按照Huoffman規則正好紅移約100nm。

菁染料Cy3和Cy5已成為基因芯片的首選熒光標記物；另外，Cy5， Cy5.5和Cy7的吸收在近紅外區背景非常低，是熒光強度高、穩定的長波長染料。特別適合于活體小動物體內成像代替放射性元素。

菁染料和生物分子的比例F/P=4～12之間熒光強度高，F/P值過高熒光探針會自我淬滅并影響生物分子的生物活性，標記生物分子好是用單琥珀酰亞胺酯，但是用雙修飾的CyDye NHS并沒有發現交聯。CyDye NHS標記抗體在pH (8.5～9.4)時10分鐘F/P可達5～6，而在pH 7.0幾乎不反應。用不同比例的Cy3標記anti-glutathione-S-transferase (GST)多克隆抗體發現用1:1, 5:1, 10:1?和20:1標記時得到的F/P值分別是0.28:1, 1.16:1, 2.3:1?和4.6:1。

水溶性SulfoCy3 NHS標記anti-GST多克隆抗體

市場上買到的抗體如果含有其它蛋白或帶氨基的緩沖液會影響標記，在標記前需純化。

1.?在1L 0.15 MNaCl?溶液中透析anti-GST抗體(濃度為0.5 mL at 3 mg/mL)，常溫透析4小時。

2.?在4°C用新鮮的1L 0.15M NaCl?溶液再透析過夜。

3.?第二天用1L 0.1M NaHCO₃(pH 8.3)透析4小時。

4.?用0.22μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

5.?用0.1M NaHCO₃稀釋少量的抗體，在280nm處測其紫外吸收值計算標記抗體的總量（IgG antibody摩爾吸光系數170 000 M-1cm-1at 280nm).?

6.?用無水DMSO配置Cy3 NHS (MW 765.95)溶液濃度為10 mg/mL；計算所需體積以得到想要的CyDye NHS?和抗體的比值(例如20:1)，然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時在暗處常溫緩慢攪拌45分鐘。

7.?用1L 0.15M NaCl?溶液常溫避光透析4小時除去未標記上的Cy3。

8.?在4°C用新鮮的1L 0.15M NaCl?溶液再避光透析過夜。

9.?用1L of 0.01M PBS/ 0.01%?疊氮化鈉溶液常溫避光透析4小時,?在4°C常溫避光再次透析過夜。

10.?用0.22μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

11.?用0.01M PBS/0.01 %?疊氮化鈉整數倍稀釋標記抗體溶液，測量280nm（蛋白）和552nm（Cy）處的紫外可見吸光度。

12.?產品冷凍干燥成粉末或在0.01M PBS/ 0.01%?疊氮化鈉溶液中，-20℃避光儲存。

SulfoCy3 在552nm摩爾吸光系數為150 000 M-1cm-1；此蛋白在280nm的摩爾吸光系數為170 000 M-1cm-1；不同蛋白的摩爾吸光系數不一樣；Cy3?染料本身在280nm的吸收是552nm處的8%。按以下公式計算F/P值。

[Cy3] = A552/150000

[antibody] = {A280- (0.08×A552)}/170000?

F/P?final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/ {A280- (0.08×A552)}