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水溶性的SulfoCy5 SE=Cy5 NHS=Cy5琥珀酰亞胺酯 (琥珀酰亞胺酯SE(Succinimidyl esters) = N-羥基琥珀酰亞胺NHS(N-Hydroxy succinimide)

菁染料是性能優良的熒光標記染料，摩爾吸光系數在熒光染料中是高的，其琥珀酰亞胺酯是常用的脂肪氨基標記試劑，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標記和檢測。通過改變次甲基鏈的長度,?可改變其熒光發射波長，每增加一個雙鍵，按照Huoffman規則正好紅移約100nm。菁染料Cy3和Cy5已成為基因芯片的首選熒光標記物;另外,Cy5, Cy5.5和Cy7的吸收在近紅外區背景非常低，是熒光強度高、穩定的長波長染料。特別適合于活體小動物體內成像代替放射性元素。

菁染料琥珀酰亞胺酯（CyDye NHS）的標記：

菁染料和生物分子的比例F/P=4～12之間熒光強度高， F/P值過過高熒光探針會自我淬滅并影響生物分子的生物活性，標記生物分子好是用單琥珀酰亞胺酯，但是用雙修飾的CyDye NHS并沒有發現交聯。 CyDye NHS標記抗體在pH (8.5～9.4)時10分鐘F/P可達5～6，而在pH 7.0幾乎不反應。我們用不同比例的 Cy3標記anti-glutathione-S-transferase (GST)多克隆抗體發現用1:1, 5:1,10:1 和 20:1標記時得到的F/P值分別是0.28:1, 1.16:1, 2.3:1 和4.6:1。

1. 水溶性Cy3 NHS標記anti-GST多克隆抗體

市場上買到的抗體如果含有其它蛋白（例如serum albumin或gelatin等）或帶氨基的緩沖液會影響標記， 在標記前需純化。

(1) 在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗體(濃度為 0.5 mL at 3 mg/mL)，常溫透析4小時。

(2) 在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再透析過夜。

(3) 第二天用1 L 0.1 M NaHCO₃ (pH 8.3)透析4小時。

(4) 用0.22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

(5) 用0.1 M NaHCO₃ 稀釋少量的抗體，在280nm處測其紫外吸收值計算標記抗體的總量 （IgG antibody摩爾 吸光系數170 000 M-1 cm-1 at 280 nm).

(6) 用DMSO配置Cy3 NHS (MW 765.95) 溶液濃度為10 mg/mL； 計算所需體積以得到想要的CyDye NHS 和抗體的比值(例如20:1)，然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時在暗處常溫緩慢攪拌45分鐘。

(7) 用1 L 0.15 M NaCl 溶液常溫避光透析4小時除去未標記上的Cy3。

(8) 在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析過夜。

(9) 用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% 疊氮化鈉溶液常溫避光透析4小時, 在4°C常溫避光再次透析過夜。

(10) 用0.22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

(11) 用0.01 M PBS/0.01 % 疊氮化鈉整數倍稀釋標記抗體溶液，測量280nm（蛋白）和552nm（Cy）處的紫 外可見吸光度。

(12) 產品冷凍干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01% 疊氮化鈉溶液中，-20℃避光儲存。

F/P計算： Cy3在552nm摩爾吸光系數為150 000 M-1 cm-1 ；此蛋白在280nm的摩爾吸光系數為170 000 M-1 cm-1 ;不同蛋白的摩爾吸光系數不一樣，Cy3 染料本身在280nm的吸收是552nm處的8%。按以下公式計算F/P值。

[Cy3] = A552/150000 [antibody] = {A280 - (0.08×A552)}/170000

F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/ {A280 - (0.08×A552)}

2. 水溶性Cy5 NHS標記 (D-ser 2 )-leucineenkephalin

(1) Cy5 NHS 1.0 mg 溶解于400 μL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2 )-leucine-enkephalin acetate (YSGFLT, 0.75 mg) 的400 μL DMSO溶液。（Dye 和peptide 投料比是 1:1）

(2) 然后加入15 μL三乙胺，常溫避光攪拌反應混合物過夜。

(3) 用HPLC 純化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上樣注入2×400 μL，30分鐘梯度洗脫從 0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O（0.1% TFA）=70∶30，流速4mL /min。（對不同的蛋白選擇不同的合適HPLC梯度流動相）

(4) 收集適當的色帶峰，標記多肽的保留時間比未標記的多肽。

(5) 產品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光儲存；必要時可用質譜表征。

(6) CyDye標記的蛋白穩定性取決于蛋白本身。例如標記的IgG在4 ℃可避光保存2月；更長期的保存需加?等體積的甘油-20 ℃避光保存。

F/P計算： Cy5 在650 nm 的摩爾吸光系數為250 000 M-1 cm-1 ，所用蛋白在280 nm處的摩爾吸光系數為 170 000 M-1 cm-1 ；Cy5在280nm處的吸收是650nm處的5%。按以下公式計算F/P值。

[Cy5 dye] = (A650)/250 000 [peptide] =[A280 -(0.05×A650)]/170 000

F/P final= [dye]/[peptide]= {0.68×A650}/ {A280 - (0.05×A650)}

3. 水溶性 CyDye SE標記OLIGO

氨基封端的OLIGO可以標記CyDye SE，但是非常困難；標記前因為OILGO經氨水脫保護，請務必洗滌掉 所有的殘余氨水。然后將樣品真空干燥；然后溶于0.25 ml 的0.5 M NaCl 溶液中，用Sephadex G-50脫鹽，用5.0 mM borate 緩沖液平衡到pH=8.0，然后用以上硼酸緩沖液沖下OLIGO。然后濃縮至干的樣品溶于 0.1 M carbonate buffer (pH 8.5-9.0)；在0.5mL碳酸緩沖液中30 nmoles的OLIGO加入到CyDye SE的玻璃 瓶中室溫避光，密閉攪拌反應60min。反應物經Sephadex G-50或 RP-HPLC過柱純化，冷凍?燥后避光保存。

4. 活體成像領域

SPF級 BALB/C裸鼠，6-8 周齡, 18-20克, 實驗前24 h 自由進食、飲水。

于實驗裸鼠腹腔內注射 2%戊巴比妥鈉 300μL(215 mg/ kg)麻醉動物。將裸鼠俯臥位平放于小動物多光譜活體成像系統的記錄暗箱中。實驗時將 Cy7 或 Cy7 標記的生物分子或藥物 DMSO 稀釋后,于裸鼠尾靜脈注射 200μL( 0.5 mg/g) [佳用量和時間需要客戶根據自己的儀器和藥物試劑等條件優化] ,每 5min 記錄 1 張動物在體內發射熒光的成像圖片,分析熒光藥物的分布情況。對照鼠不注射藥物，進行同時記錄。記錄結束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器，進行成像。

Cy7 檢測時激發波長700～770 nm 帶通 ,發射波790 nm 長通。液晶可調諧濾光片掃描范圍 780～950 nm ,掃描步進 10 nm。曝光時間為 500 ms。

不同的藥物代謝時間不一樣，注射入裸鼠體內，熒光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈現顯著的腎 排泄的特點一般 4~6 小時，快得只有 30 分鐘；如果是?骼等部位靶點的 Cy7 標記藥物，有客戶反映一周后 活體成像系統仍能檢測到熒光成像。

器官切?觀察：將解剖的器官迅速放置于 4%多聚甲醛固定 4 小時以上，0%，20%，30%PBS蔗糖依次沉底，20μm 切片，多聚賴氨酸洗過的載玻片貼片，晾干，DAPI 染色。共聚焦顯微鏡觀察，激光器為氦氖 633 nm。

未開封的粉末在避光?燥-20℃存放12月。CyDye NHS?溶液現配現用不能儲存。任何溶解后的CyDye NHS粉末好立即使用；無水的DMSO溶液-20°C保存多2個星期。