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Super Flour 488, SE 是一種可標記蛋白或其他具有胺基的生物分子的深紅?熒光染料。功能類似于 Alexa Fluor 488 ,Cy5 及 DyLightTM 649，但因其有著更高的量子范圍和極好的水溶性，使得它有更好的蛋白染色效果。此外， ALEXA FLUOR488, SE 有超強的光穩定性，因而更適用于共聚焦和單分子成像檢測。Super Flour 488, SE 的這些性質使 其成為好的蛋白和核酸染料。

1、實驗材料

IgG：IgG 不可含有可與染料反應的胺類化學物質，如: 氨基酸,Tris 等。如果 IgG 中含有此類化學物質，必須? pH～7.4 的 PBS 緩沖液預先透析處理。疊氮類化合物的存在 不會影響標記反應。

Super Flour 488, SE ；NaHCO3 ；葡聚糖凝膠 G-25 透析柱；PBS 緩沖液(pH～7.4)；NaN3；BSA。

2 、標記方法和步驟

2.1 準備標記抗體用2mL 0.1 M NaHCO3 溶液（pH～8.3）稀釋 5mg 抗體。如果產品預先用磷酸鹽緩沖液稀釋，如 PBS 緩沖液（不含胺基類化合物），那么可以直接在該緩沖液中加入約 1M 的 NaHCO3 母液，調整 NaHCO3 工作濃度至～0.1 M。低于 2.5 mg/mL 濃度的蛋白也可用于標記，不過此濃度下標記效率會降低。當蛋白濃度用于 5 mg/mL 時，標記效率可能更高。由于緩沖液和蛋白純度存在差異性，因而更精確的標記效率由實際操作條件決定。如果標記蛋白濃度稀釋過低，可以通過超濾法進行濃縮。

2.2 準備染料儲存液 室溫預熱一管 1mg Super Flour 488, SE，在管中加入 0.1 mL 的無水 DMSO，配制濃度為 10mM 染料儲存液。 適當條件下，可以渦旋以便充分溶解染料。如果使用更微量的蛋白進行標記反應，那么染料需要稀釋至更低濃度。

注：（1）剩余的染料儲存液應于-20°C 低溫存放，以備后續使用。?用無DMSO 配制染料儲存液，染料至少可以保存一個月。 

（2）染料也可以用去水配制，但是由于染料在水中會緩慢水解，所以在結合反應開始前，水配制的儲存液好現配現用。

2.3 標記反應步驟

a) 攪拌或渦旋混勻蛋白溶液，逐步滴加 30-50 μL 的染料儲存液（10 mM），使染料/蛋白的摩爾比在 9 : 1 至15 : 1 的范 圍內。如步驟 2.1 所述，蛋白稀釋濃度越高，染料/蛋白的摩爾比越高，這也意味著標記效率更低。標記 Super Flour 的 IgG 抗體佳的 DOL(結合于每個蛋白分子上 的染料數量)值在 3-6 范圍內。

b) 在室溫下攪拌反應 1 小時。

注：在進行結合反應的同時，進行步驟 2.4，平衡葡聚糖凝 膠 G-25 透析柱。

2.4 從反應液中分離標記蛋白。

a) 用PBS 緩沖液（pH～7.4）平衡葡聚糖凝膠 G-25 透 析柱（10 mm × 300 mm）。

b) 將步驟 2.3 反應溶液加入柱子，并用 1 × PBS 緩沖液洗脫。首先洗脫出來的著色帶是染料-蛋白結合物。 注：（1）對于小規模的標記反應，為了避免過度稀釋產物， 可以使?超濾裝置去除結合物中的自由染料。（2）當結合反應完成后，如不及時分離染料-蛋白結合物，可以加入 50 μL 1M 賴氨酸終止反應。多數情況下，不需要此操作，因為剩余的未反應的染料在反應后已經被充分水解。

3、確定 DOL（結合于每個蛋白分子上 的染料數量）

3.1 蛋?濃度的確定 抗體濃度可通過以下公式計算: C(mg/mL) = {[A280-(Amax × CF)]/1.4} × 稀釋因子。

(C 是指實驗收集的抗體濃度；稀釋因子是指在光度測量時的稀釋倍數（可從下面備注中獲得）；A280 和 Amax 分別是指在 280nm 處的吸光度以及在大吸收波長（~650 nm）處的吸光度；CF 是校正因子，Super Flour 488，SE 的 CF 值為 0.03；1.4 則是指 IgG（mL/mg）的消光系數；)

注：過柱洗脫的蛋白溶液直接用于吸光度檢測可能濃度 過?，因此需要稀釋到大約 0.1mg/mL。稀釋倍數（即 稀釋因子）需要從起初抗體數量（比如 5mg）以及蛋白液洗脫的總體積來進?預估。

3.2 DOL 的估算 DOL 通過下式計算: DOL = (Amax × Mwt × 稀釋因子) /(ε × C) 注意：Amax，稀釋因子，C 值在 3.1 中已經明確； Mwt是指 IgG 的分子量 (~150,000)； ε 是 Super Flour 488, SE 的摩爾吸 光系數； 標記 Super Flour 488, SE 的 IgG 抗體佳的 DOL 值在 3-6 范圍內，有時會上下略有波動。