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該試劑盒采用競爭抑制酶聯免疫吸附法原理。酶標板預包被親和純化的抗雌二醇(E2)的抗體。將待測抗原（標準品或樣本）和生物素標記的抗原加入到酶標板中，它們對固相抗體進行競爭結合。接著洗滌去除未結合的物質，加入鏈酶親和素-辣根過氧化物酶（SA-HRP）以形成固相抗體-生物素標記抗原-SA-HRP的復合物。然后，將 TMB 溶液加入孔中并進行孵育，酶促反應產生藍色物質，加入終止液后，變成黃色。顏色深淺與樣本中待測抗原的含量呈現負相關。在450nm 波長下測定吸光值。后通過建立標準曲線，根據 OD 值來計算樣品中雌二醇(E2)的濃度。

酶標儀（能測 450nm 處的吸光度）

多通道移液器或自動洗板機

恒溫箱、低溫離心機

可調節式移液槍及槍頭

去離子水

注意：各組分（小管試劑）開蓋前，請先低速離心。

1.使用前將所有試劑平衡至室溫(18-25℃)。按照酶標儀說明書進行設置檢測波長為450nm，并在讀板前預熱 15 分鐘。

2.洗滌液:取濃縮洗滌液，根據檢測數量，用去離子水或蒸餾水1：30稀釋，混勻后備用。

3.檢測試劑 A 工作液：實驗前計算所需量(100 μL/孔)。在準備工作中，應該準備比計算量稍微多一點（多 100-200μL）。使用前將原液管離心，用檢測試劑 A 稀釋液將 100×濃縮檢測試劑 A 稀釋至 1×工作液（如：10μL 檢測試劑 A + 990μL 檢測試劑 A 稀釋液）。

4.檢測試劑 B 工作液：實驗前計算所需量(100 μL/孔)。在準備工作中，應該準備比計算量稍微多一點（多 100-200μL）。使用前將原液管離心，用檢測試劑 B 稀釋液將 100×濃縮檢測試劑 B 稀釋至 1×工作液（如：10μL 檢測試劑 B + 990μL 檢測試劑 B 稀釋液）。

5.標準工作液：首先，標準品 1000×g 離心 1min，加入1mL標準品稀釋液，使其靜止10min 再輕柔混勻，這就是20ng/mL工作儲備液,然后取7個EP管，每管內加入500μL標準品稀釋液。吸取 500μL 20ng/mL標準品稀釋液到個管內再混勻即為10ng/mL 工作液。按照下表將500μL的溶液從前管移到后管中。在下一次轉移前，將每管徹底混勻。設定7個梯度稀釋標準品如20ng/mL,10ng/mL,5ng/mL,2.5ng/mL,1.25ng/mL， 0.625ng/mL,0.31ng/mL后1個裝有標準品稀釋液的 EP 管是空白對照作為0ng/mL。

注意：每次實驗，請使用新配制的標準品。

血清：讓血樣在室溫下凝結 2 小時或在 2-8℃下過夜，然后在 2-8℃下 2000×g 離心 15 分鐘。隨后立即取上清液進行檢測，或存儲在-20℃或-80℃備用。

血漿：使用 EDTA 或肝素作為抗凝劑收集血漿。采集后 30 分鐘內，在 2-8℃,2000×g 條件下離心樣品 15 分鐘，隨后立即取上清液進行檢測，或存儲在-20℃或-80℃下備用。

組織勻漿：應在預冷的 PBS 中沖洗組織，徹底清除多余的血液，稱重，切成小塊。然后在冰上的采用玻璃勻質器在 PBS（組織重量（g）：PBS（mL）體積=1：9）中均質化組織塊。使用超聲波細胞破碎機對所得勻質懸浮液進行超聲處理，直到溶液澄清。然后將勻漿在 10000×g 下離心 5 分鐘。隨后立即取上清液進行檢測，或存儲在-20℃或-80℃下備用。

細胞裂解物：對于粘附細胞，用適量預冷的 PBS 輕輕清洗細胞，并用胰蛋白酶分離細胞。以 1000×g 離心 5 分鐘收集細胞（懸浮細胞可直接離心收集）。棄上清，用冷 PBS 清洗細胞 3 次。以濃度為5×10⁶ 個細胞/1mL 預冷 PBS 重新懸浮細胞。重復凍融數次，直到細胞完全溶解。1500×g，2-8℃離心 10min。隨后立即取上清液進行檢測，或存儲在-20℃或-80℃下備用。

細胞培養上清和其他生物體液：在 1500×g，2-8℃條件下離心樣品15分鐘。隨后立即取上清液進行檢測，或存儲在-20℃或-80℃下備用。

注意：不要使用嚴重溶血或脂血的標本。如果樣品要在6天內使用，則可以將其儲存在2-8℃，長期保存需分裝存儲在-20℃或-80℃，避免反復凍融。測定前，應將冷凍樣品緩慢升至室溫并輕輕混合。

1.分別設置標準品孔和樣本孔。依次加入 8個不同濃度的標準品（含零孔，50μL/孔），樣本孔加入50μL待測樣本（根據實際情況確定是否設置復孔），然后立即加入檢測試劑A工作液，50μL/孔，輕輕晃動混勻，蓋上試劑盒提供的封板膜，37℃孵育60分鐘。

2. 手工洗板：棄去每孔中的液體，每孔加入350μL洗滌液。浸泡30秒再倒出每孔中液體并在干凈的吸水紙上拍干。重復這個洗滌步驟，共3遍。洗板機洗板：選擇洗滌3次程序洗板后拍干。

3.每孔加入100μL 的檢測試劑B工作液。蓋上封板膜。37℃孵育30分鐘。

4.棄去每孔中的液體，重復步驟 2 的洗滌過程5遍。

5.每孔加入90μL 的TMB試劑。蓋上新的封板膜。37℃避光孵育 10-20 分鐘（當標品濃度梯度后三孔有明顯藍色梯度，前三孔的梯度不明顯時即可終止）。

6.每孔加入 50μL 的終止液，順序與加入底物溶液(TMB)的順序一致，輕輕晃動混勻。

7.確保酶標板孔底無氣泡水霧等，立即在 450nm 測量每孔的吸光度 OD 值。

以x 軸為OD值，y軸為標準品濃度擬合一條標準曲線，通過回歸分析確定回歸方程。將樣本OD值作為x帶入方程計算y值（濃度）。

典型標準曲線（R2≥0.99）

雌二醇(E2)標準曲線。數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線

1. 實驗過程中請穿戴實驗服、口罩和乳膠手套。請按照生物實驗室的國家安全規定進行實驗，尤其是在檢測血樣或其他體液時。終止液有一定的腐蝕性，操作時請做好防護措施。

2. 本試劑盒僅用于實驗室科學研究，如果本試劑盒用于臨床診斷或任何其他用途，我們將不對任何后果負責。

3. 本試劑盒應在有效期內使用，并請嚴格按照說明書進行存儲。收到試劑盒后，未開封的試劑盒可在2-8℃下保存1個月。如果試劑盒在1個月內不使用，請在收到試劑盒后，將每個組件分別存放在上表中指示的溫度下。

4. 新打開的ELISA酶標板可能含有水霧樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果產生任何影響。未用完的板條應立即放回裝有干燥劑的鋁箔袋中，重新密封并在-20℃下存儲。

5. 不同批次號、不同廠家之間的組分不要混用；否則，可能導致結果異常。

6. 勤換吸頭，避免各組分之間的交叉污染。

7. 溶解含有蛋白質溶液時，應始終避免起泡。

8. 不得重復使用稀釋后的工作液。

9. 為了得到準確的實驗結果，在孵育過程中，必須確保封板膜將酶標板密封。

10. 在使用自動洗板機時，添加清洗緩沖液后，在清洗步驟之間添加30秒的浸泡時間可提高分析精度。

11. 底物溶液(TMB)保存過程中應為無色，加入到酶標板中之后底物溶液應從無色變為漸變藍色。

12. 終止液應按照與加底物溶液(TMB)相同的順序添加到酶標板中。添加終止液后，孔中溶液的顏色將從藍色變為黃色。綠色的孔表明終止液未與底物溶液充分混合，應輕拍孔板使其混勻。