γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）是還原型谷胱甘肽（GSH）合成的限速酶，GSH對(duì)GCL有反饋抑制作用。GCL基因表達(dá)受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性的高低對(duì)于GSH含量和GSH/GSSG比值有非常重要的影響。 本試劑盒可檢測(cè)生物體內(nèi)GCL活性，其原理是在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同時(shí)ATP去磷酸化產(chǎn)生無機(jī)磷分子，通過測(cè)定無機(jī)磷增加速率，即可計(jì)算出GCL活性。
酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)（能測(cè)660 nm處的吸光度）及水浴鍋
96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭
低溫離心機(jī)、制冰機(jī)
去離子水和濃硫酸
勻漿器（如果是組織樣本）
注意：各組分（小管試劑）開蓋前，請(qǐng)先低速離心。
提取液：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。
試劑一：臨用前96 T加6 mL去離子水，48 T加3 mL去離子水，充分震蕩溶解，用不完的試劑分裝-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
試劑二：臨用前加96 T加1.5 mL去離子水，48 T加0.75 mL去離子水，充分震蕩溶解。（配制完成后，4℃保存，請(qǐng)一周內(nèi)使用完。）
試劑三：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。
試劑四：臨用前96 T加12 mL去離子水，48 T加6 mL去離子水，充分震蕩溶解后，96 T緩緩加入400 μL濃硫酸（自備），48 T緩緩加入200 μL濃硫酸（自備）邊加邊攪拌。
注意：濃硫酸具有強(qiáng)腐蝕性，請(qǐng)注意安全。配制過程中，可能會(huì)產(chǎn)生黑色固體，其不影響結(jié)果，注意吸取時(shí)不要將黑色固體吸入。該溶液配制完成后應(yīng)為淺黃色，若為藍(lán)色則已污染，不可再使用。
標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置： 按下表所示用去離子水將8μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.125 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。
標(biāo)準(zhǔn)品體積 | 去離子水體積（μL） | 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL） | |
Std.1 | 100 μLof 8 μmol/mL | 900 | 0.8 |
Std.2 | 100 μL of Std.1（0.8 μmol/mL） | 100 | 0.4 |
Std.3 | 100 μL of Std.2 (0.4 μmol/mL) | 100 | 0.2 |
Std.4 | 100 μL of Std.3 (0.2 μmol/mL) | 100 | 0.1 |
Std.5 | 100 μL of Std.4 (0.1 μmol/mL) | 100 | 0.05 |
Std.6 | 100 μL of Std.5 (0.05 μmol/mL) | 100 | 0.025 |
Std.7 | 100 μL of Std.6 (0.025 μmol/mL) | 100 | 0.0125 |
注意：每次實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)使用新配制的標(biāo)準(zhǔn)品。
1. 動(dòng)植物組織樣本：稱取約0.1 g組織，加入1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，8,000 g，4℃離心10 min，取上清，置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌、細(xì)胞：收集500萬細(xì)胞加入1 mL 提取液，冰浴超聲波破碎細(xì)胞5 min（功率20%或200 W，超聲3 s，間隔7 s，重復(fù)30次）；然后8,000 g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清（漿）等液體：直接測(cè)定。
注意：1. 推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復(fù)凍融。
2. 細(xì)胞中GCL活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細(xì)胞中GCL的提取時(shí)可加提取液后超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。
3. 如需要進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定時(shí)，推薦用BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒。
1. 酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長到660 nm，可見分光光度計(jì)去離子水調(diào)零。
2. 水浴鍋預(yù)熱到37℃。
3. 樣本測(cè)定（在EP管中依次加入下列試劑）：
空白管（μL） | 標(biāo)準(zhǔn)管（μL） | 測(cè)定管（μL） | 對(duì)照管（μL） | |
提取液 | 0 | 0 | 48 | 48 |
試劑一 | 0 | 0 | 52 | 52 |
試劑二 | 0 | 0 | 12 | 12 |
樣本 | 0 | 0 | 24 | 0 |
混勻后蓋緊，37℃水浴反應(yīng)15 min | ||||
試劑三 | 0 | 0 | 60 | 60 |
樣本 | 0 | 0 | 0 | 24 |
混勻后，室溫（25℃左右）8,000 g，離心10 min | ||||
上清 | 0 | 0 | 100 | 100 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 0 | 100 | 0 | 0 |
去離子水 | 100 | 0 | 0 | 0 |
試劑四 | 100 | 100 | 100 | 100 |
混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻至室溫后測(cè)定660 nm處光吸收，盡快測(cè)完，分別記為A空、A測(cè)定、A標(biāo)、A對(duì)照。計(jì)算 ΔA測(cè)=A測(cè)定-A對(duì)照，ΔA標(biāo)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白，空白管只需做一個(gè) | ||||
注意：測(cè)定吸光值時(shí)，請(qǐng)于水浴后10-40min內(nèi)測(cè)完。樣本測(cè)定前先取2-3個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如ΔA測(cè)大于1.5，應(yīng)先用提取液（或生理鹽水）稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，使得吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，哺乳動(dòng)物組織和血液一般稀釋3-5倍，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為y軸，ΔA標(biāo)為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度為y軸更方便計(jì)算結(jié)果）。
2. γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）活性的計(jì)算
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測(cè)帶入公式中（x）計(jì)算樣品無機(jī)磷濃度y（μmol/mL）。
（1）按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活力單位。
GCL(U/mg prot)=(y×V反總)÷(Cpr×V樣)÷T=0.54×y÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
活性單位定義：37℃下，每克樣品每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活力單位。
GCL(U/g 鮮重)=(y×V反總)÷(W÷V樣總×V樣)÷T=0.54×y÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：37℃下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活單位。
GCL(U/104 cell)=(y×V反總)÷(500×V樣÷V樣總)÷T=1.08×10-3×y
（4）按血清（漿）等液體體積計(jì)算
活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活單位。
GCL(U/mL)=(y×V反總)÷V樣÷T=0.54×y
V反總：反應(yīng)總體積，0.196 mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V樣：加入樣品體積，0.024 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；W：樣品鮮重，g；V樣總：加入提取液的體積，1 mL；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬
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答：可能的原因有：
1、膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻；
2、某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或?qū)悠符}濃度調(diào)成一致；
3、緩沖液陳舊，成分改變,可以重配；
4、凝膠下面有氣泡,電泳前要先將氣泡趕走；
5、電泳時(shí)溫度過高，可以降低電流或電壓；
6、樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分?jǐn)嚢杌靹颉?/p>
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