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γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)是γ-谷氨酰循環中的關鍵酶，催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基轉移到受體,也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解，產生谷氨酸鹽，在細胞外谷胱甘肽新陳代謝中起了重要的作用。本試劑盒提供了一種簡單的檢測方法，用于檢測生物樣本，如血清（漿）、動植物組織、細胞、細菌樣本中γ-GT的活性。原理是γ-GT催化谷氨酰對硝基苯胺中γ-谷氨酰基轉移給N-甘氨酰甘氨酸，生成對硝基苯胺，在405 nm有特征光吸收；通過測定405 nm光吸收增加速率，來計算γ-GT酶活性。

酶標儀或可見分光光度計（能測405 nm處的吸光度）及水浴鍋

96 孔板或微量玻璃比色皿、低溫離心機、制冰機

可調節式移液槍及槍頭

去離子水

勻漿器（如果是組織樣本）

提取液：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。

工作液：臨用前配制；將試劑二加入試劑一充分溶解（室溫過低時可以40℃水浴促進溶解）；然后將試劑三加入試劑一瓶中；4℃保存。

樣本制備

組織樣本：稱取約0.1 g組織，加入1 mL 提取液，進行冰浴勻漿，8,000 g，4℃離心15 min，取上清，置冰上待測。

細胞、細菌：收集500萬細菌或細胞加入1 mL 提取液，冰浴超聲波破碎細胞3 min（功率20%或200 W，超聲3 s，間隔7 s）；然后8,000 g，4℃，離心15 min，取上清，置于冰上待測。

血清（漿）等液體：直接測定。

注意：1. 推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復凍融。

2. 細胞中γ-GT活性測定時，細胞數目須在300萬-500萬之間，細胞中γ-GT的提取時可加提取液后超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞（防止因為蛋白質變性導致酶失活）。

3. 如需要進行樣本蛋白質濃度測定時，推薦用BCA法蛋白質定量試劑盒。

1. 酶標儀或可見分光光度計預熱30 min以上，調節波長到405 nm，可見分光光度計去離子水調零。

2. 工作液置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中預熱30min以上（保證無沉淀）。

3. 樣本測定：在96 孔板或微量玻璃比色皿中  依次加入20μL樣本，180μL工作液，

迅速混勻后于405 nm處測定10s和70s時的吸光度，記為A₁，A₂計算ΔA=A₂-A₁。

注意：1. 實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA小于0.001可適當加大樣本量；如果ΔA大于0.5樣本可用去離子水進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數。

2. 測定反應的溫度對測定結果有影響，請控制在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）。

3. 因通過反應速率計算酶活，使用96孔UV板時請根據操作速度控制一次測定的樣本數（通常一次測定4-8個樣本）。

A. 使用96孔板測定的計算公式

1. 按蛋白濃度計算

活性單位（U）定義：25℃或37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產生1nmol對硝基苯胺為一個活性單位。

γ-GT(U/mg prot)=[ΔA×V_反總÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V_樣)÷T=2026×ΔA÷Cpr

2. 按樣本鮮重計算：

活性單位（U）定義：25℃或37℃中，每克組織每分鐘催化產生1nmol對硝基苯胺為一個活性單位。

γ-GT(U/g 鮮重)=[ΔA×V_反總÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V _樣總×V_樣)÷T=2026×ΔA÷W

3. 按血清（漿）計算：

活性單位（U）定義：25℃或37℃中，每毫升血清每分鐘催化產生1nmol對硝基苯胺為一個活性單位。

γ-GT(U/mL)=[ΔA×V_反總÷(ε×d)×10⁹]÷V_樣÷T =2026×ΔA

4. 按細菌或培養細胞計算：

單位的定義：25℃或37℃中，每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol對硝基苯胺為一個活性單位。

γ-GT(U/10⁴ cells)=[ΔA×V_反總÷(ε×d)×10⁹]÷(500÷V _樣總×V_樣)÷T= 4.053×ΔA

V _樣：加入樣品體積，0.02 mL； V _樣總：加入提取液體積，1 mL；V_反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；T：反應時間，1 min； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； W：樣本質量，g； 500：500萬細胞； ε：對硝基苯胺消光系數，9870 L/mol/cm； d：比色皿光徑， 0.5 cm；10⁹：單位換算系數，1 mol=10⁹ nmol。

B. 使用微量玻璃比色皿進行測定的計算公式

將上述計算公式中光徑 d：0.5 cm 調整為 d：1 cm 進行計算即可。