谷胱甘肽是甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸組成的天然三肽。在紅細胞中，還原型谷胱甘肽是維持血紅蛋白處于還原狀態的關鍵，保護細胞免受氧化損傷。谷胱甘肽有還原型（GSH）和氧化型（GSSG）兩種形態，氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽的氧化形式，又稱為二硫代谷胱甘肽，是兩分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG會被谷胱甘肽還原酶還原成GSH，因此機體中大多數是以還原型形式存在。還原型谷胱甘肽是絕大多數活細胞中巰基的主要來源，對于維持蛋白質中巰基適當的氧化還原狀態有重要作用，并且是動物細胞中關鍵的抗氧化劑。
測定細胞內 GSH 和 GSSG含量以及 GSH/GSSG 比值，能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態，也是谷胱甘肽氧化還原循環的主要指標之一。本試劑盒提供了一種簡單的檢測方法檢測各種生物樣本中GSH和GSSG的含量。其原理是GSH能和5,5'-二硫代-雙-（2-硝基苯甲酸）（5,5'-Dithiobis-2-Nitrobenoicacid，DTNB）反應生成2-硝基-5-巰基苯甲酸，該物質為黃色，在412nm波長處具有大光吸收，來測定樣本中GSH的含量。
通過2-乙烯吡啶抑制樣品中原有的還原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）將GSSG還原為GSH，借此測定氧化型谷胱甘肽的含量。
酶標儀或可見光分光光度計（能測412nm處的吸光度）及恒溫箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可調節式移液槍及槍頭
制冰機、低溫離心機、去離子水、勻漿器（如果是組織樣本）
注意：各組分（小管試劑）開蓋前，請先低速離心。
提取液：即用型；4℃保存。
GSH反應緩沖液：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。
GSSG反應緩沖液：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。
試劑一：即用型；使用前，避光平衡到室溫；-20℃避光保存。
試劑二稀釋液：使用時，按取試劑二 6μL加水0.12mL的比例配制，整個實驗過程中，冰上避光放置。現用現配，用多少配多少；4℃避光保存。
試劑三：使用前96T加1.5mL去離子水，48T加0.75mL去離子水溶解；分裝-20℃避光保存。
試劑四：使用時每瓶加入5mL去離子水，4℃避光保存。
標準品制備:
稀釋提取液：按1:10的比例用去離子水稀釋提取液，如：取500μL 提取液加入4,500μL去離子水。
GSH標準品：
50mM GSH標準品：每管GSH標準品含15.4mg GSH，使用時加1mL稀釋后的提取液得50mM GSH標準品，4℃避光保存。
1000μM GSH標準品：取20μL 50mM GSH標準品用 980μL稀釋后的提取液稀釋。
使用1000μM GSH標準品，按照下表所示，進一步稀釋標準品：
標準品體積 (μL) | 稀釋后的提取液體積 (μL) | 標準品濃度(μM) | |
Std.1 | 200μL 1000μM | 0 | 1000 |
Std.2 | 100μL of Std.1（1000μM） | 100 | 500 |
Std.3 | 100μL of Std.2 （500μM） | 100 | 250 |
Std.4 | 100μL of Std.3（250μM） | 100 | 125 |
Std.5 | 100μL of Std.4（125μM） | 100 | 62.5 |
Std.6 | 100μL of Std.5（62.5μM） | 100 | 31.25 |
Std.7 | 100μL of Std.6（31.25μM） | 100 | 15.6 |
注意：每次實驗，請使用新配制的標準品；配制好的標準品需要在4h之內使用。
GSSG標準品：
20mM GSSG標準品：取1管標準品，用1mL 稀釋后的提取液溶解得20mM GSSG標準品；4℃避光保存。
20μM GSSG標準品：取1μL 20mM GSSG標準品用 999μL稀釋后的提取液稀釋，使用20μM GSSG標準品，按照下表所示，進一步稀釋標準品：
標準品體積 (μL) | 稀釋后的提取液體積 (μL) | 標準品濃度(μM) | |
Std.1 | 200 | 0 | 20 |
Std.2 | 100μL of Std.1 | 100 | 10 |
Std.3 | 100μL of Std.2 | 100 | 5 |
Std.4 | 100μL of Std.3 | 100 | 2.5 |
Std.5 | 100μL of Std.4 | 100 | 1.25 |
Std.6 | 100μL of Std.5 | 100 | 0.625 |
Std.7 | 100μL of Std.6 | 100 | 0.313 |
注意：每次實驗都要做一次標準品檢測，制作標曲；稀釋后的標準品溶液不穩定，必須在4小時內使用。
動物組織：稱取0.1g組織樣本，加入1mL預冷的提取液，快速冰上勻漿。勻漿后的樣本，8,000 g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。
植物組織：稱取0.1g植物組織剪碎，加入1mL預冷的提取液，快速冰上勻漿。勻漿后的樣本冰浴超聲波破碎
5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次）。超聲后的樣本，8,000g，4℃離心10min，取上清
液，置冰上待測。
血清或血漿：按常規方法收集血清，加入等體積的提取液，4℃，8,000g離心10min，取上清液，置冰上待測。將收集的抗凝血于4℃，600g離心10min，30min內吸取上層血漿到另一支試管中，加入等體積的提取液，4℃，8,000g離心10min，取上清液，置冰上待測。
血細胞：將收集的抗凝血于4℃，600g離心10min，棄去上層血漿，用PBS重懸，收集5×106個血細胞，用冷PBS清洗2次（用PBS重懸血細胞，4℃ 600g離心10min），加入1mL預冷的提取液，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次）。超聲后的樣本，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。
細胞或細菌：收集5×106個細胞或細菌，首先用冷PBS清洗細胞2次（用PBS重懸細胞，4℃ 600g 離心10min），加入1mL預冷的提取液重懸細胞或細菌，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次）。超聲后的樣本，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。
注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。提取過程中去掉蛋白質，所以提取液不能用于測定蛋白含量。
GSH測定：
1．酶標儀或可見光分光光度計預熱30min以上，調節波長至412nm，可見光分光光度計去離子水調零。
2．在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加樣：
試劑（μL） | 空白孔 | 標準孔 | 測定孔 |
樣本 | 0 | 0 | 20 |
稀釋后的提取液 | 20 | 0 | 0 |
標準品 | 0 | 20 | 0 |
GSH反應緩沖液 | 140 | 140 | 140 |
試劑四 | 40 | 40 | 40 |
充分混勻，37℃避光孵育10min,記錄10min時的吸光度A空、A標、A測。計算ΔA測=A測-A空，ΔA標=A標-A空（空白和標準曲線只需測定一次）。
注意：實驗之前建議選擇 2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA測小于0.005可適當加大樣本量。如果ΔA測大于2.0，樣本可用去離子水進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數。
GSSG測定：
1. 酶標儀或可見光分光光度計預熱30 min以上，調節波長至412nm，可見光分光光度計去離子水調零。
2. 試劑二稀釋液、試劑三和試劑四37℃保溫10min。
3．在EP管中按照如下方式加樣：
試劑（μL） | 空白 | 標準 | 測定 |
去離子水 | 0 | 0 | 90 |
稀釋后的提取液 | 100 | 0 | 0 |
標準品 | 0 | 100 | 0 |
樣本 | 0 | 0 | 10 |
試劑一 | 5 | 5 | 5 |
混勻，37℃孵育30min，取21μL混合液于微量玻璃比色皿或96孔板中 | |||
混合液 | 21 | 21 | 21 |
GSSG反應緩沖液 | 140 | 140 | 140 |
試劑二稀釋液 | 2 | 2 | 2 |
試劑三 | 20 | 20 | 20 |
試劑四 | 40 | 40 | 40 |
4．充分混勻，37℃避光孵育10min,記錄10min時的吸光度A空、A標、A測。計算ΔA測=A測-A空，ΔA標=A標-A空（空白和標準曲線只需測定一次）。
注意：1. 實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA測小于0.005可適當加大樣本量。如果ΔA測大于2.0，樣本可用去離子水進一步稀釋，計算結果乘以終稀釋倍數。
2. 如果樣本量過多，可將GSSG反應緩沖液、試劑二稀釋液、試劑三與試劑四按照比例混勻配成工作再加入。
GSH含量：
1. 標準曲線的繪制
以標準品濃度為y軸，ΔA標為x軸，繪制標準曲線（濃度為y軸更方便計算結果）。
2. GSH含量的計算
將樣本的ΔA測代入方程得到y值（1μM=1nmol/mL）。
（1）按樣本鮮重計算
GSH（nmol/g 鮮重）=y×V樣÷(W×V樣÷V樣總)×n=y÷W×n
（2）按液體樣本體積計算
GSH（nmol/mL）=2×y×V樣÷V樣×n=2y×n
（3）按細胞數目計算
GSH（nmol/104 cells）=y×V樣÷(500×V樣÷V樣總)×n=y÷500×n=0.002×y×n
V樣：加入樣本體積，0.02mL；W：樣本質量，0.1g；V樣總：加入提取液體積，1mL；n：樣本進一步稀釋的稀釋倍數；2：液體樣本制備時的稀釋倍數，加入等體積的提取液即稀釋2倍；500：細胞數量，500萬。
GSSG含量：
1. 標準曲線的繪制
以標準品濃度為y軸，ΔA標為x軸，繪制標準曲線（濃度為y軸更方便計算結果）。
2. GSSG含量計算
將ΔA測帶入方程得到y值（1μM=1nmol/mL）。
（1）按樣本鮮重計算
GSSG（nmol/g 鮮重）=y×V樣÷(W×V樣÷V樣總)×10×n=10y÷W×n
（2）按液體樣本體積計算
GSSG（nmol/mL）=2×y×V樣÷V樣×10×n=20y×n
（3）按細胞數目計算
GSSG（nmol/104 cells）=y×V樣÷(500×V樣÷V樣總)×10×n=0.02y×n
V樣：反應中加入樣本體積，0.002mL,根據比例折算10μL×(21÷105)=2μL；W：樣本質量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；10：樣本檢測時的稀釋倍數,(10+90)÷10；2：液體樣本制備時的稀釋倍數，加入等體積的提取液即稀釋2倍；n：樣本進一步稀釋的稀釋倍數；500：細胞數量，500萬。
總谷胱甘肽含量：
總谷胱甘肽=GSH+2×GSSG
2：1個GSSG分子在反應后可以還原成2個GSH分子。
典型標準曲線
GSH標準曲線
GSSG標準曲線
1. 實驗過程中請穿戴實驗服、口罩和乳膠手套。請按照生物實驗室的國家安全規定進行實驗，尤其是在檢測血樣或其他體液時。
2. 本試劑盒僅用于實驗室科學研究，如果本試劑盒用于臨床診斷或任何其他用途，我們將不對任何后果負責。
3. 本試劑盒應在有效期內使用，并請嚴格按照說明書進行存儲。
4. 不同批次號、不同廠家之間的組分不要混用；否則，可能導致結果異常。
5. 勤換吸頭，避免各組分之間的交叉污染。
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