蘇木素(Hematoylin)和伊紅(Eosin)聯合染色簡稱HE染色,是病理學和組織學常用的一種染色方法,蘇木精為堿性天然染料,可使細胞核著色;細胞核內染色質的主要成分是 DNA,在DNA的雙螺旋結構中,兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外,使DNA雙螺旋的外側帶負電荷,呈酸性,很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵或氫鍵結合而被染色。
改良Mayer蘇木素染色液無毒,無氧化膜,細胞核染色質著色深而細微,臨床上常替代Harris蘇木素染色液;對細胞核染色很清晰,不著染胞質和纖維成分,屬進行性染色故染色后可以不用鹽酸乙醇分化染色時間約5-8min ,如果是充分氧化后可染色3-5min。該試劑常用于糖原等特染、酶組化和免疫組化等染色后復染細胞核作對照染色,尤其適用于經過特殊染色后不能經酸處理時對細胞核的復染,在特殊染色中常與天青石藍B液聯合染色,使細胞核染色后不被后續的酸性染料所褪色。該試劑僅用于科研領域,不適用于臨床診斷或其他用途。
(一)石蠟切片染色
1、切片脫蠟至水
①二甲苯或浸蠟脫蠟透明液作用2次,每次5 ~ 10min。
②(可選)無水乙醇作用2次,每次3~ 5min.
③95%乙醇3 ~ 5min
④90%乙醇3 ~ 5min
⑤80%乙醇3 ~ 5min
⑥自來水或蒸餾水(亦可用30~ 40°C溫水)沖洗1 ~ 3min
2、染色
①改良Mayer蘇木素染色液5~ 8min
②自來水或蒸餾水沖洗5~ 10s
③(可選)鹽酸乙醇分化2~ 5s
④自來水沖洗20~ 30s
⑤藍化液或溫水返藍20~ 40s
⑥80%乙醇脫水30 ~ 60s
⑦伊紅染色液(醇溶)染色30s ~ 3min
3、脫水、透明、封固
①80%乙醇10 ~ 20s
②90%乙醇10~ 20s
③95%乙醇作用2次,每次1 ~ 2min。
④無水乙醇作用2次,每次2~ 3min。
⑤二甲苯或浸蠟脫蠟透明液透明3次,每次2 ~ 3min。
⑥中性樹膠封片。
(二)冰凍切片染色
1、乙醚-乙醇混合固定液5~ 10s
2、自來水沖洗2~ 5s
3、蘇木素染色液滴染1 ~ 2min(可加熱至50°C)。
4、自來水沖洗2~ 5s
5、(可選)鹽酸乙醇分化2~ 5s
6、自來水沖洗2~5s
7、藍化液或溫水返藍2~ 5s
8、80%乙醇脫水5~ 10s
9、伊紅染色液(醇溶)染色2~ 5s
10、80%乙醇1~ 2s
11、95%乙醇1~ 2s
12、無水乙醇2~ 5s
13、苯酚二甲苯(1:3)2~ 5s
14、二甲苯或浸蠟脫蠟透明液透明3次,每次2~ 5s。15、中性樹膠封片。
(三)細胞染色
1、4%多聚甲醛固定10 ~ 20min.
2、自來水沖洗2次,每次2min。
3、蒸餾水沖洗2次,每次2min。
4、染色、脫蠟、透明、封固步驟同石蠟切片的染色步驟,作用時間應相應縮短。
1.切片脫蠟應盡量干凈。
2.系列乙醇應經常更換新液。
3.鹽酸乙醇分化時間應根據切片厚薄、組織類別以及新舊而定,另外分化后自來水沖洗時間應該足夠,以便徹底清洗酸。
4.乙醚-乙醇混合固定液是由乙醚和95%乙醇等量混合而得, 再加入適量乙酸,密閉保存。
5.冷凍切片染色時間盡量要短。
6.藍化液常使用0.2-1%氨水或Scott促藍液或0.1-1%碳酸鋰溶液。
7.為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴-次性手套操作。
8.本產品僅限于專業人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內。
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答:可能的原因有:
1、目的蛋白有多個修飾位點,本身可以呈現多條帶,建議查閱文獻或進行生物信息學分析,獲得蛋白序列的修飾位點信息,通過去修飾確定蛋白實際大小;
2、樣本處理過程中目的蛋白發生降解,建議加入蛋白酶抑制劑;樣本處理時在冰上操作;
3、雜蛋白多,建議處理目的蛋白;
4、抗體特異性不強,建議使用特異性強的抗體;
5、抗體孵育時間過久,建議減少抗體孵育時間;
6、二抗與抗原有交叉反應,建議選擇合適的封閉物;
7、二聚體或多聚體存在,建議增加蛋白質變性過程及強度;
8、底物顯色與曝光時間過長,建議縮短顯色及曝光的時間。
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