抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)是破骨細胞 的標志性酶,特異性分布于破骨細胞中。TRAP染色試劑盒即是用于顯示組織中的破骨細 胞。其中基本原理在于,在含酒石酸的酸性條件下,抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP能將萘酚 AS-BI磷酸鹽水解,產生的萘酚AS-BI與六偶氮副品紅結合,形成非水溶性的酒紅色物質 沉積在酶活性原位,從而實現對抗酒石酸酸性磷酸酶的顯色和定位。
本產品基本組成成分:反應緩沖液主要成分為醋酸緩沖液及酒石酸鉀鈉,pH約5.0;副品 紅溶液,含5%副品紅;亞硝酸鈉溶液主要成分為4%亞硝酸鈉;AS-BI磷酸鹽底物溶液, 主要成分為20 mg/mL萘酚AS-BI磷酸鹽。經本產品染色后,破骨細胞中的TRAP呈酒紅色 ,定位于細胞漿。按照切片上每個組織點300 μL用量,本試劑盒可以做50次以上TRAP 染色。
配制 TRAP 工作液:
1)取50μL副品紅溶液與50μL亞硝酸鈉溶液在潔凈離心管中混勻,得到六偶氮副品紅 溶液;
2)向第1步的100μL六偶氮副品紅溶液中加入100μLAS-BI磷酸鹽底物溶液, 吹吸數 次充分;
3)吸取1.8mL反應緩沖液加入到第2步的混合液中充分混勻;
4)第3步的混合液經針式濾器過濾(0.45μm 水系濾膜)即得到TRAP 工作液。
注意:務必按照所屬順序配制工作液。每個組織點大約需要200-300μL工作液,根據使 用量配制,現配現用,避免浪費。 石蠟切片操作步驟(供參考)
1.石蠟切片脫蠟至水, 純水洗數分鐘。
2.將切片用組化筆化圈后放在(加有一定量的防止切片蒸干的純水)濕盒中,用純水37 ℃孵育2h。
3.切片孵育完成后傾去純水,滴加過濾好的TRAP 工作液覆蓋組織,置于37℃避光反應 20-30 min。
4.(可選,自備相關試劑)復染細胞核:傾去孵育液并水洗,以蘇木素染液進行染核。
5.脫水,透明,以中性樹膠封片。
細胞爬片操作步驟(供參考)
1.細胞固定:吸除細胞培養液,加入4%多聚甲醛(推薦 G1101)固定15-30min,蒸餾水 洗3次。
2.細胞破膜:以0.2%TritonX-100溶液覆蓋細胞進行破膜處理20-30min,蒸餾水輕洗3 遍。
3.孵育染色:將TRAP 工作液加到細胞孔板內覆蓋細胞,37℃避光孵育20min,蒸餾水洗 3次。
4.(可選,自備相關試劑)細胞核復染:吸除孵育液并水洗,以蘇木素染液進行染核。
5.加入適量無水乙醇脫水,取出孔板中的蓋玻片,吹風機吹干,倒扣在潔凈的載玻片上 以中性樹膠封片。
1.僅用于科研,不能用于臨床診斷。所有產品僅供科研使用,不得用于其他用途。
2.為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
1.Wang G ,Xu L Y ,Zhang H X , et al.LncRNA HOTTIP regulates TLR4 promoter methylation by recruiting H3K4 methyltransferase MLL1 to affect apoptosis and inflammatory response of fibroblast-like synoviocyte in rheumatoid arthritis.[J].The Kaohsiung journal of medical sciences,2024,40(4):335-347.(IF 2.7)
答:可能的原因有:
1、目的蛋白有多個修飾位點,本身可以呈現多條帶,建議查閱文獻或進行生物信息學分析,獲得蛋白序列的修飾位點信息,通過去修飾確定蛋白實際大小;
2、樣本處理過程中目的蛋白發生降解,建議加入蛋白酶抑制劑;樣本處理時在冰上操作;
3、雜蛋白多,建議處理目的蛋白;
4、抗體特異性不強,建議使用特異性強的抗體;
5、抗體孵育時間過久,建議減少抗體孵育時間;
6、二抗與抗原有交叉反應,建議選擇合適的封閉物;
7、二聚體或多聚體存在,建議增加蛋白質變性過程及強度;
8、底物顯色與曝光時間過長,建議縮短顯色及曝光的時間。
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