細胞或組織用多聚甲醛、甲醛或其它醛類試劑固定后,會導致蛋白之間的交聯(cross-link),從而遮蔽樣品的抗原位點,導致免疫染色時染色信號減弱,甚至出現一些假陽性染色結果。
本抗原修復液采用了廣泛使用的EDTA,可以有效去除醛類固定試劑導致的蛋白之間的交聯,充分暴露石蠟切片等樣品中的抗原表位,從而大大改善免疫染色效果。
通常石蠟切片都需進行抗原修復處理,而冰凍切片可以不進行抗原修復處理。抗原修復會大大改善石蠟切片的免疫染色效果,但對于冰凍切片的染色效果很多文獻資料表明也有顯著改善。特別是當冰凍切片免疫染色效果欠佳時,可以考慮嘗試進行抗原修復。從原理上來看,無論冰凍切片還是細胞爬片等,只要是用多聚甲醛、甲醛或其它醛類試劑固定的樣品,進行抗原修復都會有效去除蛋白之間的交聯,充分暴露抗原表位,從而大大改善免疫染色效果。
本產品特別適合用于石蠟切片,也可以用于冰凍切片等其它樣品。
1.對于石蠟切片:
a.脫蠟:切片在二甲苯中脫蠟5分鐘,再換用新鮮的二甲苯脫蠟,共用二甲苯脫蠟3次。無水乙醇5分鐘,兩次。90%乙醇5分鐘,兩次,70%乙醇5分鐘,一次。蒸餾水5分鐘,兩次。
b.抗原修復:將切片浸泡在抗原修復液(1X)中,95-100℃加熱約15分鐘(加熱時間可以控制在10-20分鐘內,佳的加熱時間需根據不同的樣品和目的蛋白自行摸索)。抗原修復液(1X)使用前需預熱到95-100℃。加熱可以使用普通的水浴鍋,也可以使用微波爐加熱。如果使用微波爐加熱,需注意避免暴沸和過多的水分蒸發。隨后大約在20-30分鐘內冷卻至室溫。用免疫染色洗滌液洗滌1-2次,每次3-5分鐘。隨后即可進行封閉等后續的免疫染色步驟。
2.對于冰凍切片:
用免疫染色洗滌液洗滌切片5分鐘。將切片浸泡在抗原修復液(1X)中,95-100℃加熱約15分鐘(加熱時間可以控制在10-20分鐘內,佳的加熱時間需根據不同的樣品和目的蛋白自行摸索)。抗原修復液(1X)使用前需預熱到95-100℃。加熱可以使用普通的水浴鍋,也可以使用微波爐加熱。如果使用微波爐加熱,需注意避免暴沸和過多的水分蒸發。隨后大約在20-30分鐘內冷卻至室溫。用免疫染色洗滌液洗滌1-2次,每次3-5分鐘。隨后即可進行封閉等后續的免疫染色步驟。
3.對于其它樣品的抗原修復,可以參考石蠟切片或冰凍切片的步驟進行。
塑料染色缸、染色架和郵寄夾可以很好地耐受沸水浴,而玻璃染色缸需避免驟冷驟熱導致的玻璃破碎。
本抗原修復液使用前必須用重蒸水或Milli-Q水稀釋50倍,配制成抗原修復液(1X)。
本產品僅限于專業人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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答:可能的原因有:
1、目的蛋白有多個修飾位點,本身可以呈現多條帶,建議查閱文獻或進行生物信息學分析,獲得蛋白序列的修飾位點信息,通過去修飾確定蛋白實際大小;
2、樣本處理過程中目的蛋白發生降解,建議加入蛋白酶抑制劑;樣本處理時在冰上操作;
3、雜蛋白多,建議處理目的蛋白;
4、抗體特異性不強,建議使用特異性強的抗體;
5、抗體孵育時間過久,建議減少抗體孵育時間;
6、二抗與抗原有交叉反應,建議選擇合適的封閉物;
7、二聚體或多聚體存在,建議增加蛋白質變性過程及強度;
8、底物顯色與曝光時間過長,建議縮短顯色及曝光的時間。
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