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Cy5.5-N-羥基琥珀酰亞胺酯，水溶性菁染料是性能優良的熒光標記染料, 具有很好的水溶性和很高的摩爾吸光系數，其琥珀酰亞胺酯是常用的脂肪氨基標記試劑，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標記和檢測。特別是Cy5.5和Cy7的吸收在近紅外區，已廣泛用于活體成像領域來代替放射性元素。在哺乳動物體內血紅蛋白是吸收可見光的主要成分, 能吸收中藍綠光波段的大部分可見光; 水和脂質主要吸收紅外線，因此選擇激發和發射光譜位于650nm-900nm(近紅外窗口)的近紅外熒光標記的紅光雖然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動物組織被敏感的CCD檢測到，更有利于活體光學成像，特別是深層組織的熒光成像。

Cy5.5 NHS標記IgG

1. 標記前注意事項：本標記方案僅供參考，使用時請根據自己的抗體適當修改。待標記的抗體或蛋白等物質，不能含有BSA, gelation, free amino acid and ammonium salt等. 這些雜質參與標記反應，需要純化掉這些雜質后才能標記。

2. 標記需要的器材和試劑：

Cy5.5 NHS； IgG抗體，1M NaHCO₃溶液， PBS緩沖液pH=7.2～7.4； 1M NaOH或者1M HCl

Sephadex G-25凝膠層析柱，聚丙烯酰胺凝膠填料或其它脫鹽柱。 

3. 將1mL 10mg/mL IgG抗體（約0.0667mM）用NaHCO₃平衡到pH=8.5～9.5, 然后分四次加入現配現用的Cy5.5 無水DMSO溶液，每次100uL每次間隔10min。 （1mg Cy5.5 NHS溶在100uL無水DMSO中）

4. 抗體和染料的混合液在常溫充分攪拌2h后純化。

5. 用Sephadex G-25凝膠層析柱，聚丙烯酰胺凝膠填料純化標記后的抗體，PBS緩沖液pH=7.2～7.4作為洗脫液，收集收集適當的色帶峰。

6. 產品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光儲存；必要時可用質譜表征。

7. 標記的蛋白穩定性取決于蛋白本身。例如標記的IgG在4℃可避光保存2月；更長期的保存需加入等體積的甘油-20℃避光保存。

Cy5.5 NHS標記 (D-ser2)-leucine enkephalin

1. Cy5.5 NHS 1.0 mg 溶解于400 μL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2)-leucine-enkephalin acetate (YSGFLT, 0.75 mg) 的400 μL DMSO溶液。（Dye 和peptide 投料比是 1:1）

2. 然后加入15 μL三乙胺，常溫避光攪拌反應混合物過夜。

3. 用HPLC 純化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上樣注入2×400 μL，30分鐘梯度洗脫從0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O（0.1% TFA）=70∶30，流速4mL /min。（對不同的蛋白選擇不同的合適HPLC梯度流動相）

4.  收集適當的色帶峰，標記多肽的保留時間比未標記的多肽長。

5.  產品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光儲存；必要時可用質譜表征。

6. CyDye標記的蛋白穩定性取決于蛋白本身。例如標記的IgG在4 ℃可避光保存2月；更長期的保存需加入等體積的甘油-20 ℃避光保存。