傳說中的一步法ELISA有何玄機？
在前面的《啥是ELISA？》一文中，我們給大家簡單介紹了ELISA的四種主要類型。今天我們再講解一個經常聽到的概念-一步法ELISA。
我們知道ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。
ELISA中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體、酶作用的底物。
今天要說的一步法ELISA其實是雙抗體夾心法在常規的基礎上進行變化的一個變種。介紹一步法ELISA以前我們還是先說說下夾心法。
夾心法簡介
夾心法（Sandwich ELISA）分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法：
雙抗原夾心法
雙抗原夾心法中抗原被包被于固相，檢測樣本中的抗體結合于抗原后，使用酶標的抗原進行結合及后續反應，可以用來測定樣本中的抗體。雙抗原夾心法的關鍵在于酶標抗原的制備，需要根據抗原結構進行設計，在醫學檢驗上測定抗HBsAg抗體采用的就是此法，檢測時被測樣本不需要稀釋即可直接進行測定，故此靈敏度相對而言高于我們隨后要說的間接法。
雙抗原夾心法（圖片來源：網絡）
雙抗體夾心法
雙抗體夾心法中抗原的2個不同的抗原表位被兩個抗體——捕捉抗體和檢測抗體，分別結合。捕捉抗體固定于載體即酶標板上，檢測抗體通過結合抗原進行顯色分析。應用于雙抗體夾心法檢測的捕捉抗體通常是單抗，偶爾有用多抗做為捕捉抗體的情況，但很少見，因為以多抗作為捕捉抗體容易出現交叉反應而降低特異性。檢測抗體通常為多抗。根據具體的實驗步驟又分為幾個基本的類型：
傳統的HRP酶標記抗體的雙抗體夾心法
常規的雙抗體夾心法是，針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，其中酶標抗體通常為HRP酶標記的檢測抗體。適用于測定大分子抗原，不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
帶有生物素－親和素放大系統的雙抗體夾心法
生物素－親和素系統（Biotin-Avidin—System，BAS）是70年代末發展起來的一種新型生物反應放大系統。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應用于醫學各領域。近年大量研究證實，生物素—親和素系統幾乎可與研究成功的各種標記物結合。生物素與親和素之間高親合力的牢固結合以及多級放大效應，使BAS免疫標記和有關示蹤分析更加靈敏。它已成為廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術。在商業化的科研試劑盒中經常用到生物素標記的山羊多抗，再讓生物素標記的多抗與HRP標記的親和素或者鏈霉親和素結合，然后再加HRP也就是辣根過氧化物酶的底物，通常是TMB反應顯色，這種方法是在傳統的HRP酶標記抗體的雙抗體夾心法ELISA中引入了生物素-親和素放大系統。不過也有用單抗做檢測抗體的情況，尤其是在科研中。
雙抗體夾心法（圖片來源：網絡）
啥是雙抗體夾心一步法ELISA？
雙抗體夾心法具有高靈敏度、高專一性的優勢，但該法只適用于有多個結合位點的抗原檢測，主要用于檢測各種大分子抗原——例如在醫學檢測中測定HBsAg、HBeAg、AFP等疾病相關的，以及在科研中檢測細胞因子等。由于雙抗體夾心法特異性高，為了節省時間，在傳統的HRP酶標記抗體的雙抗體夾心法檢測過程中有時會將樣本和酶標抗體同時加入進行反應，就稱為雙抗體夾心一步法。這樣整個實驗過程中只需要一次孵育和一個洗板步驟快僅需一小時，因為操作時間短，在商業化生產中有很大優勢。
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